不同抗凝剂对鲫鱼外周血的抗凝效果研究

刘凯 谢楠 马恒甲 姚桂桂

摘要[目的]研究不同抗凝剂对鲫鱼外周血的抗凝效果。[方法]以鲫鱼“中科3号”为研究对象， 比较5种抗凝剂对鲫鱼外周血的抗凝效果，探讨其适宜抗凝剂品种和有效抗凝浓度。[结果]除了L-半胱氨酸在试验条件下不能作为有效抗凝剂外，其余4种抗凝剂延长血液凝固时间均在61.43 min以上。肝素钠、柠檬酸钠、草酸钾和EDTA的有效抗凝浓度分别为（0.80±0.17）、（1.42±0.14）、（1.17±0.14）和（2.33±0.58） mg/mL。显微镜下，肝素钠、柠檬酸钠、草酸钾和EDTA 4种抗凝剂均能较好地维持鲫鱼外周血细胞的形态。[结论]该研究结果可为鲫鱼外周血抗凝剂的应用提供参考。

关键词鲫鱼； 外周血； 抗凝剂；抗凝效果

中图分类号S965.117文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）08-0115-02

Study on the Anticoagulation Effect of Different Anticoagulants on Peripheral Blood of Crucian Carp

LIU Kai，XIE Nan，MA Hengjia et al （Hangzhou Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou，Zhejiang 310024）

Abstract[Objective] To study the anticoagulation effect of different anticoagulants on peripheral blood of crucian carp.[Method] Using crucian carp cultivar “Zhongke No.3” as research object，the anticoagulation effects of five kinds of anticoagulants on peripheral blood of crucian carp were compared.The suitable kind of anticoagulant and its effective concentration for peripheral blood of crucian carp were discussed.[Result] Under these test conditions，except for Lcysteine，other four kinds of anticoagulants could prolong the blood coagulation time more than 61.43 min.The effective anticoagulation concentrations of heparin sodium，sodium citrate，potassium oxalate and EDTA were （0.80±0.17），（1.42±0.14），（1.17±0.14） and （2.33±0.58） mg/mL respectively.Under the microscope，the hemocyte morphology of peripheral blood in crucian carp treated with heparin sodium，sodium citrate，potassium oxalate and EDTA could be well maintained.[Conclusion] The research can provide references for the application of anticoagulants for peripheral blood of crucian carp.

Key wordsCrucian carp；Peripheral blood；Anticoagulant；Anticoagulation effect

動物血液中血细胞随着血液的循环流动，执行着许多生理功能，在气体运输、机体免疫和凝血过程中起着重要作用。若要分离出血细胞，试验中就需要使用抗凝剂。然而，关于鲫鱼外周血的适宜抗凝剂种类和有效抗凝浓度的研究报道较少。笔者以鲫鱼“中科3号”为研究对象，比较5种抗凝剂对鲫鱼外周血的抗凝效果，探讨适合鲫鱼外周血的抗凝剂种类及有效抗凝浓度，以期为鲫鱼外周血抗凝剂的应用提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料试验用鲫鱼“中科3号”采自杭州市农业科学研究院水产研究所，鱼体健康，体重400～450 g；草酸钾、柠檬酸钠、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）和肝素钠均为国产分析纯，L-半胱氨酸为生化试剂（含量>98.5%）。

1.2试验方法

试验共选用5种抗凝剂（草酸钾、柠檬酸钠、乙二胺四乙酸二胺、肝素钠、L-半胱氨酸），根据预试验结果将每种抗凝剂均设置5个浓度梯度，所有抗凝剂均用0.1 mol/L PBS作为溶剂。

用1 mL的无菌注射器先吸取0.1 mL抗凝剂，再从鲫鱼尾部侧线鳞上方插入，从尾部静脉抽取0.4 mL外周血，混合均匀后，立即注入聚乙烯离心管中。自血液进入注射器时立即开始计时，此后每隔15 min轻轻倾斜离心管1次，观察血液是否流动，当血液不能流动时停止计时，即为血液凝固时间。每个抗凝剂浓度重复3次，血液凝固时间取3次重复的平均值。以0.1 mol/L PBS为对照组，以3.7%甲醛固定的外周血细胞作为形态对照。

按照以下公式计算抗凝剂延长血液凝固时间：抗凝剂延长血液凝固时间=试验组凝固时间-对照组凝固时间。以能延长血液凝固时间1 h以上并经显微镜检查血细胞形态完整的抗凝剂作为鲫鱼的有效抗凝剂，其对应的最低浓度即为该抗凝剂对鲫鱼的最低有效浓度。

2结果与分析

以0.1 mol/L PBS为对照组，鲫鱼外周血凝固时间为（1.43±0.40） min，因此在该试验条件下若试验组抗凝剂延长血液凝固时间在61.43 min以上，则视为有效抗凝剂。

由表1可知，除了L-半胱氨酸不能作为有效抗凝剂外，其余4种抗凝剂延长血液凝固时间均在61.43 min以上，肝素钠、柠檬酸钠、草酸钾和EDTA的有效抗凝浓度分别为（0.80±0.17）、（1.42±0.14）、（1.17±0.14）和（2.33±0.58） mg/mL。用3.7%甲醛固定的鲫鱼外周血细胞绝大部分为圆形、椭圆形及梭形等，细胞形态完整。肝素钠、柠檬酸钠、草酸钾和EDTA 4种抗凝剂也均能较好地维持鲫鱼外周血细胞的形态，无细胞破裂现象（图1）。

3结论与讨论

该试验结果表明，当肝素钠、柠檬酸钠、草酸钾和EDTA的浓度分别达到（0.80±0.17）、（1.42±0.14）、（1.17±0.14）和（2.33±0.58） mg/mL时，均可作为鲫鱼“中科3号”的抗凝剂。李义[1]和张峰等[2]研究表明，肝素钠、柠檬酸钠、EDTA等也可作为日本沼虾和刺参的抗凝剂。张明辉等[3]研究表明肝素钠、柠檬酸钠、EDTA等不适宜作为中华绒螯蟹的抗凝剂。该试验结果表明，肝素钠、柠檬酸钠、EDTA等在大多数情况下可作为生物的有效抗凝剂。对少数物种而言，由于血液凝固机制的差异或其他原因造成现有抗凝剂的失效。该试验结果表明，肝素钠、柠檬酸钠、EDTA等抗凝剂对不同品种鲫鱼外周血的有效抗凝剂量也存在差异，如彭泽鲫的有效抗凝浓度显著高于“中科3号”，这可能与鱼的体重、生理状态等有关。

肝素钠抗凝的主要机制在于它能结合血浆中的抗凝蛋白，从而阻止血液凝固[4]。用肝素钠抗凝时，当肝素钠浓度未达到有效浓度时，肝素钠无法充分结合血浆中的抗凝蛋白，则无法起到抗凝作用。用肝素钠抗凝时发现，短时间内肝素钠抗凝细胞凝集现象明显，长时间后细胞凝集现象明显减少。在日本沼虾[1]、刺参[2]中均有类似发现，而对于中华绒螯蟹肝素钠则无法抗凝，可能是因为肝素钠不能与中华绒鳌蟹中的特异抗凝蛋白结合。此外，肝素钠对鲫鱼“中科3号”的有效抗凝浓度为（0.80±0.17） mg/mL，与日本沼虾（0.6～1.4 mg/mL）类似，高于刺参（0.2～0.6 mg/mL）。

柠檬酸钠抗凝的主要机制在于其能与血液中的钙离子形成不易解离但可溶解的络合物，减少血液中钙离子浓度，从而阻止血液凝固[4]。该试验结果表明柠檬酸钠对鲫鱼“中科3号”的有效抗凝浓度为（1.42±0.14） mg/mL，略高于肝素钠，其对刺参的有效抗凝浓度为3.8～5.4 mg/mL，对血细胞形态无显著影响。Durliat等[5]研究表明10%柠檬酸钠能很好地阻止血液凝固且不影响血细胞形态，这与该試验结果类似。对日本沼虾[1]的研究表明柠檬酸钠的有效抗凝浓度应在10 mg/mL以上，且造成细胞溶血；对中华绒螯蟹[3]的有效抗凝浓度在25 mg/mL以上，也造成细胞溶血。在鲤鱼上[6]，柠檬酸钠能较好地抗凝血细胞凝固且维持血细胞形态，不发生溶血。

草酸钾的抗凝机理是与血液中的钙离子结合形成不溶性的草酸钙沉淀，阻止血液凝固从而起到抗凝的作用[4]。草酸钾对鲫鱼“中科3号”的有效抗凝浓度为（1.17±0.14） mg/mL，试验中未观察到明显的白色絮状沉淀，显微镜下细胞形态良好，但高浓度下有明显的溶血现象。但是，血液学研究中较少使用草酸盐抗凝，因其可能存在溶血及影响血液中某些物质的生物活性。在日本沼虾[1]及中华绒螯蟹[3]上，草酸钾均能抗凝血液，但都引起血液溶血。在对刺参[2]的研究中，1.0～1.5 mg/mL草酸钾能有效抗凝，且不影响血细胞形态，但1.5 mg/mL草酸钾抗凝2 h以上出现溶血及破裂现象，与该试验结果类似。在对鲤鱼[6]的研究中也发现，草酸钾能较好地抗凝血细胞凝固，但红细胞会发生溶血现象。

EDTA是通过络合血液中的钙离子而阻止血液发生凝固的[4]。在日本沼虾[1]的研究中，1.5 mg/mL的EDTA可以使其血液超过72 min不凝固且能维持血细胞形态无变化；在刺参[2]的研究中也有类似的发现，当EDTA浓度为1.5 mg/mL时，其细胞存活率也最高。当EDTA浓度≥2.0 mg/mL时，刺参血细胞的凝集程度减轻，但细胞形态保持较差，细胞存活率低。在中华绒螯蟹[3]上，EDTA对其细胞有一定的破坏作用，且其有效抗凝浓度为15.0 mg/mL。该试验结果表明，EDTA对鲫鱼“中科3号”的有效抗凝浓度为（2.33±0.58） mg/mL，略高于日本沼虾和刺参，对鲫鱼血细胞形态无明显影响。

该试验结果表明，L-半胱氨酸不能延长鲫鱼“中科3号”的血液凝固时间在61.43 min以上，可能与试验浓度过低有关，但半胱氨酸在0.1 mol/L PBS中溶解度有限。在对日本沼虾[1]的研究中，L-半胱氨酸浓度在1.0 mg/mL以上时，可使其血液凝固时间超过86 min，且能较好地维持血细胞的形态。在中华绒鳌蟹[3，7]的研究中也有类似的发现。当L-半胱氨酸浓度太低时，对中华绒鳌蟹的血液无明显抗凝作用，当L-半胱氨酸浓度达100 mg/mL时，则可对其血液有效抗凝，且细胞存活率在90%以上。在对对虾[8]的研究中也有类似发现，半胱氨酸的有效抗凝浓度为150 mg/mL。

该试验结果可为鲫鱼外周血抗凝剂的应用提供参考。

参考文献

[1]

李义.6种常用抗凝剂对日本沼虾血淋巴液抗凝效果的研究[J].水利渔业，2001，21（6）：41-42.

[2] 张峰，宋志东，刘洪伟，等.4种抗凝剂对刺参体腔细胞的抗凝效果[J].大连水产学院学报，2006，21（1）：87-89.

[3] 张明辉，陆宏达.中华绒螯蟹血淋巴液抗凝剂的筛选[J].水产科技情报，2005，32（增刊）：93-99.

[4] 张镜如，乔健天.生理学[M].4版.北京：人民卫生出版社，1997：71-73.

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[6] 李玉荣，李双安，武现军，等.不同抗凝剂对鲤鱼血细胞形态的影响[J].动物学报，2005，51（增刊）：95-99.

[7] 刘凯，陆宏达.中华绒螯蟹血细胞体外吞噬能力的研究[J].南方水产，2007，3（6）：47-51.

[8] 薛清刚，王文兴.对虾疾病的病理与诊断[M].青岛：青岛海洋大学出版社，1992：19-32.