L—色氨酸生产菌株TPO1发酵条件研究

李维理

摘要：对L-色氨酸生产基因工程菌TP01发酵的接种量、发酵温度和溶氧等条件进行了研究。结果表明，该菌株的最佳发酵条件初始培养基组成为葡萄糖30 g/L、硫酸铵40 g/L、酪氨酸0.2 g/L、玉米浆25 mL/L、磷酸氢二钾10 g/L、磷酸二氢钾5 g/L、七水硫酸镁2 g/L、硫酸钠0.002 g/L、七水硫酸亚铁0.01 g/L、维生素B1 100 μg/L、维生素H 50 μg/L，流加糖为浓度70%的葡萄糖（质量体积比），pH为7.0，温度为37 ℃，接种量为10%，溶氧控制在20%～30%。

关键词：L-色氨酸；基因工程菌；发酵优化

中图分类号：TQ922 文献标志码：A 文章编号：1001-1463（2017）07-0057-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2017.07.014

Abstract：The genetically engineered bacterium TP01 was one L-tryptophan fermentation producing strain. The culture conditions such as inoculum size， temperature and dissolved oxygen were studied to confirm the optimal fermentation conditions. The results showed that the optimal fermentation medium was glucose 30 g/L， （NH4）2SO4 40 g/L， tyrosine 0.2 g/L， corn steep liquor 25 mL/L， K2HPO4 10 g/L， KH2PO4 5 g/L， MgSO4·7H2O 2 g/L， Na2SO4 0.002 g/L， FeSO4·7H2O 0.01 g/L， vitamin B1 100 μg/L， vitamin H 50 μg/L. The optimum fermentation conditions of L-tryptophan were 70% （m/v） amount of glucose， pH 7.0， fermentation temperature 37 ℃， inoculum size 10% and dissolved oxygen 20%～30%.

Key words：L-tryptophan； Genetically engineered bacterium； Fermentation optimization

L-色氨酸是人体和动物生命活动所需的8种必需氨基酸之一，以游离态或结合态存在于生物体中[1 - 3 ]，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着非常重要的作用，被称为第二必需氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料等行业[4 - 5 ]。Eiteman等根据代谢控制发酵原理对L-色氨酸发酵进行了研究[6 - 8 ]。笔者对L-色氨酸生产菌株TP01的发酵条件（发酵接种量、发酵温度及溶氧控制等）进行了试验，以期明确TP01菌株的最佳发酵条件，为相关科学研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种 供试菌株为基因工程菌TP01。

1.1.2 培养基 菌种培养基：葡萄糖30 g/L、硫酸铵5 g/L、蛋白胨4 g/L、酵母粉2 g/L、磷酸氢二钾1 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、七水硫酸镁0.5 g/L，混匀后于0.1 MPa灭菌20 min，pH 6.8～7.0。发酵培养基：葡萄糖30 g/L、硫酸铵 40 g/L、酪氨酸 0.2 g/L、玉米浆25 mL/L、磷酸氢二钾 10 g/L、磷酸二氢钾5 g/L、七水硫酸镁2 g/L、硫酸钠0.002 g/L、七水硫酸亚铁0.01 g/L、维生素B1 100 μg/L、维生素H 50 μg/L，流加糖为浓度70%的葡萄糖（质量体积比）。

1.2 菌种培养

从生长良好的基因工程菌TP01活化培养基斜面刮满环菌苔，转入装有100 mL种子培养基的无挡板三角瓶（容量500 mL）中，用8层纱布封口，置于巡回式摇床上振荡培养。

1.3 5 L罐发酵

将菌种液通过火圈直接接种至5 L自动控制发酵罐中，装液量3 L，温度自控，自动流加氨水控制pH，起始通风量为80 L/h，流加“泡敌”消泡，通过流加葡萄糖、控制不同的搅拌转速及通风量来实现不同的溶氧。溶氧为相对溶氧水平，即将培养基未接种时的饱和溶氧设定为100%，发酵过程显示的溶氧水平为相对于饱和溶氧的分数。

1.3.1 菌种接种量对发酵效果的影响 菌种发酵中，如菌株接种量太少，菌体增长缓慢，培养时间长，使发酵周期延长，同时会降低菌种活力，不利于得到较高的产酸水平；菌株接种量过大，虽然缩短了长菌的时间，但会因菌数增长过快和随接种而移入过多的代谢废物，菌种容易衰老，不利于得到较高的产酸水平；适宜的接种量既能保证合理缩短发酵周期，又能得到较高的发酵产酸水平。为了确定菌株TP01色氨酸发酵最佳种子接种量，进行了不同接种量的发酵试验。根据发酵试验的常用接种浓度分别试验了5%接种量、7%接种量、10%接种量、12%接种量、15%接种量5个不同的接种浓度，根据种子的生长条件，发酵在pH 7.0、37 ℃、溶氧30%±5%（按常规溶氧控制条件）条件下进行，重复3批试验，以48 h产酸求平均值计算各接种浓度的产酸量，确定最佳的接种浓度。

1.3.2 菌液pH对发酵效果的影响 菌种发酵过程中较高或较低pH均会抑制菌体的生长，使菌体生长缓慢，延长发酵周期，降低色氨酸产量。根据色氨酸发酵菌株TP01的生长pH，进行了不同pH发酵试验。由于菌株TP01的生长pH为7.0，因此选择pH 6.6、6.8、7.0、7.2、7.5等5个不同pH进行试验，根据种子的生长条件，发酵在37 ℃、接种量10%、溶氧30%±5%（按常规溶氧控制条件）条件下进行，重复3批试验，以48 h产酸求平均值計算各pH的产酸量，确定最佳的发酵pH。

1.3.3 温度对发酵效果的影响 温度对发酵的影响主要表现在发酵前期影响菌体的生长和在发酵中后期影响菌体产酸。温度适宜，菌体生长好，菌体量大，L-色氨酸产量高，糖酸转化率也高。温度偏低，菌体生长较慢，对原料的转化效率低。温度偏高，菌体易衰老，不利于L-色氨酸的积累。根据色氨酸发酵菌株TP01的生长温度，进行了不同温度发酵试验。由于菌株TP01的生长温度为37 ℃，因此选择33、35、36、37、39 ℃等5个不同的温度进行发酵试验，根据种子的生长条件，发酵在pH 7.0、接种量10%、溶氧30%±5%（按常规溶氧控制条件）条件下进行，重复3批试验，以48 h产酸求平均值计算各温度下的产酸量，确定最佳的发酵温度。

1.3.4 不同溶氧水平对发酵效果的影响 发酵过程中，通过流加70%葡萄糖（质量体积比）、控制不同的搅拌转速及通风量来实现不同的溶氧。将溶氧分别控制在10%～20%、20%～30%和30%～40% 3个水平进行发酵试验，发酵在pH 7.0、37 ℃、接种量10%条件下进行，重复3批试验，以48 h为发酵终点，每4 h采集1次数据，采用发酵液吸光度和产酸量来评价不同的溶氧控制条件的优劣，确定最佳的发酵溶氧浓度控制。

1.4 分析方法

使用分光光度计测定600 nm波长下的吸光度，确定菌体浓度；使用pH计测定pH；采用SBA-40C型生物传感分析仪测定残糖；采用液相色谱测定L-色氨酸含量[9 ]。

2 结果与分析

2.1 菌株接种量对发酵效果的影响

由图1可以看出，当菌株TP01接种量为10%时，L-色氨酸浓度最大，达到25.8 g/L，即菌株TP01的产酸量达到最大，因此菌株TP01发酵的最佳接种量为10%。

2.2 菌液pH对发酵效果的影响

由图2可以看出，当发酵pH为7.0时，菌株发酵效果最好，L-色氨酸浓度最高，达到26.3 g/L，即菌株TP01的产酸量达到最大。因此，确定菌株TP01发酵的最佳pH为7.0。

2.3 发酵温度对发酵效果的影响

由图3可以看出，当发酵温度为37 ℃时，发酵液中L-色氨酸含量最高，达到25.6 g/L，即菌株TP01的产酸量达到最大，表明菌株TP01发酵的最适温度为37 ℃。

2.4 溶氧浓度对发酵效果的影响

在不同的溶氧水平下，菌体的生长量都能达到一个相近的饱和值，但菌体的生长速率存在差异。由图4和图5可以看出，当溶氧控制在20%～30%水平时，菌体生长最快，发酵产酸量也高，发酵液中L-色氨酸含量也相应最高；当溶氧控制在30%～40%水平时，菌体生长速度有所降低，产酸量也较低；当溶氧浓度控制在10%～20%水平时，菌体生长较为缓慢，产酸量最低，L-色氨酸含量也相应最低。可见溶氧浓度偏低或偏高对于发酵产酸都是不利的，特别是溶氧浓度偏低时不但对菌体的生长不利，也不利于发酵产酸。因此，菌株TP01发酵过程中溶氧浓度应控制在20%～30%。

3 小结

研究表明，菌株TP01最佳发酵条件的培养基组成为葡萄糖30 g/L、硫酸铵 40 g/L、酪氨酸 0.2 g/L、玉米浆25 mL/L、磷酸氢二钾 10 g/L、磷酸二氢钾5 g/L、七水硫酸镁2 g/L、硫酸钠0.002 g/L、七水硫酸亚铁0.01 g/L、维生素B1 100 μg/L、维生素H 50 μg/L，流加糖为浓度70%葡萄糖（质量体积比）；发酵pH为7.0，发酵温度37 ℃，接种量为10%，溶氧控制在20%～30%。

参考文献：

[1] 杨 炜，王伟刚，田海英，等. 重组大肠杆菌高表达高密度发酵研究[J]. 生物技术，2006，16（3）：83-86.

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[3] 黄 静，史建明，霍文婷，等. 氮源对L-色氨酸发酵的影响[J]. 食品与发酵工业，2011，37（5）：21-25.

[4] 赵春光，程立坤，徐庆阳，等. 微生物法生产L-色氨酸的研究进展[J]. 发酵科技通讯，2008，37（4）：34-36.

[5] 程立坤，黄 静，秦永锋. 代谢副产物乙酸对L-色氨酸发酵的影响[J]. 微生物学通报，2010，37（2）：166-173.

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[7] 涂桂云，李 敏. 基因工程菌高密度發酵工艺研究进展[J]. 工业微生物，2004，34（3）：49-52.

[8] SHIIO I，SUGIMOTO S，KAWAMURA K. Production of L-tryptophan by sulfonamide-resistant mutants[J]. Agricultural and Biological Chemistry，1984，48（8）：2073-2080.

[9] 童群义，陈 坚. 分批培养时pH和温度对重组大肠杆菌生产谷胱甘肤合成酶系的影响[J]. 工业微生物，2001，31（4）：17-21.

（本文责编：郑丹丹）