多粘类芽孢杆菌DN—1固态发酵条件优化

胡飞 苏卫华 胡本进 周子燕 徐丽娜 陈浩梁 苏贤岩

摘要[目的]探讨多粘类芽孢杆菌DN-1固体发酵条件。[方法]以活菌数和芽孢率为指标，采用单因素和多因素试验对DN-1菌株的最适培养基成分及发酵条件进行优化。[结果]菌株DN-1最适培养基配比为：15%稻壳，40%玉米粉，20%马铃薯，10%茶渣饼，15%水，0.1%磷酸氢二钾和0.2%硫酸锰。最适发酵条件为：发酵时间72 h，发酵温度37 ℃，初始pH 6.5～7.0，接种量10%。优化后菌株DN-1活菌数、芽孢率分别达26.3亿/g、92%。[结论]试验结果为DN-1菌株的进一步研究及应用提供了参考。

关键词多粘类芽孢杆菌DN-1；活菌数；芽孢率；发酵；优化

中图分类号S476文献标识码A文章编号0517-6611（2017）09-0151-04

Optimizing Solid Fermentation Condition for Paenibacillus polymyxa DN1

HU Fei， SU Weihua， HU Benjin* et al

（Institute of Plant Protection and Agroproducts Safety， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031）

Abstract[Objective] The aim was to discuss solid fermentation condition for Paenibacillus polymyxa DN1. [Method] We optimized the best solid medium and fermentation conditions of Paenibacillus polymyxa DN1 by the single factor and muti factor experiments. [Result] The optimum medium for Paenibacillus polymyxa DN1 was 15% rice husk， 40% corn flour， 20% potato， 10% oilteacake， 15%water， 01% K2HPO4 and 0.2% MnSO4. The optimal fermentation conditions were fermentation time for 72 h， temperature at 37 ℃， pH at 6.5-7.0 and 10% inoculation quantity. The yield and ratio of spore formation were 2.63 billion spores /g and 92%， respectively. [Conclusion] The results provide reference for further study and application of Paenibacillus polymyxa DN1.

Key wordsPaenibacillus polymyxa DN1；Yield；Ratio of spore formation；Fermentation；Optimize

多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）由于其具有植物防病和植物促生作用、对人畜安全和无污染等优点而受到重视，美国环保署（EPA）将其列为可在商业上应用的微生物之一[1]。目前利用多粘类芽孢杆菌防治植物病害的报道较多。例如，国内利用多粘类芽孢杆菌开发出的生物农药康地雷得对黄瓜枯萎病等有较好防效[2-3]；郭芳芳等[4]发现1株多粘类芽孢杆菌对水稻稻瘟病菌等具有显著拮抗效果。为提高多粘类芽孢杆菌的产量和芽孢率，许多研究者对芽孢杆菌发酵条件进行优化[5-10]。王哲等[11]采用单因素多浓度和响应面试验设计法，对菌株 KLBMP 033 液态培养工艺进行了优化。周青等[12] 研究表明，经条件优化后培养的解淀粉芽孢杆菌 BS2004对番茄青枯病的防治效果达 80%。目前多粘类芽孢杆菌多采用液体深层发酵技术，再经喷雾干燥进行生产，对设备要求高，生产工艺复杂，而固体发酵采用的原料一般是廉价的农副产品（如稻壳、麸皮等），采用的设备也较液体发酵简单，生产成本大大低于液体发酵，近年来各生产厂家都在积极探索芽孢杆菌的固体发酵技术。因此，研究多粘类芽孢杆菌的固态发酵条件可为开发高效、低毒生物农药提供有效途径。

安徽省農业科学院植物保护与农产品质量安全研究所筛选的多粘类芽孢杆菌DN-1具有广谱抗植物病原真菌作用，對离体水稻纹枯病（Rhizoctonia solani Kühn）、油茶炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides Penz）等作用效果显著。目前，有关多粘类芽孢杆菌固态发酵条件和发酵工艺的研究较少，鉴于此，该研究所进行了多粘类芽孢杆菌DN-1不同组分培养基固体发酵产菌量试验，以期简化生产工艺，提高产量和芽孢率，降低生产成本，为进一步应用提供数据支持。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株。

多粘类芽孢杆菌DN-1，于青岛海域海泥中分离（Genebank登录号：KM891591），由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所保存。

1.1.2培养基。

液体种子培养基：马铃薯20.0%，葡萄糖20%，氯化钠 0.5%，磷酸氢二钾0.1%。

固体发酵培养基：麸皮、稻壳、玉米粉、马铃薯、茶渣饼（油茶副产品）、磷酸氢二钾、硫酸锰。

1.2方法

1.2.1多粘类芽孢杆菌DN-1产菌量测定。

采用混匀平皿活菌计数法，按10倍稀释法制成不同浓度稀释液，从各浓度稀释液中分别吸取0.1 mL 置于无菌培养皿中，每个稀释浓度做2个平皿。将事先融化并冷却至50 ℃左右的固体培养基向每培养皿中倒入12.0 mL，摇匀，凝固后放入37 ℃培养箱中倒置培养24 h，进行菌落记数。

1.2.2多粘类芽孢杆菌DN-1芽孢率测定。

采用芽孢革兰氏染色，显微镜下观察。

1.2.3发酵培养基成分优化。

1.2.3.1

碳源的筛选。分别以40%稻壳、蔗糖、木屑、麸皮和玉米粉作为碳源，40%酵母粉作为氮源。将各组分加入20%水中浸泡4 h，装袋高压灭菌45 min，待温度降到40 ℃左右后接入液体种子菌液，接种量为10%，搅拌混匀，发酵培养。37 ℃发酵72 h后，停止发酵，期间定时取样检查，每处理4 次重复。

1.2.3.2

氮源的筛选。分别以 40%酵母粉、黄豆粉、豆粕、马铃薯、茶渣饼，40%蔗糖作为碳源。其他条件同“1.2.3.1”，每处理4次重复。

1.2.3.3

无机盐的筛选。40%酵母粉、40%蔗糖培养基中分別添加 0.2%的 氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸锰、氯化锌和氯化钙，其他条件同“1.2.3.1”，每处理4次重复。

1.2.3.4

多种培养基组合试验。以单因子试验筛选出的最佳碳源、氮源、无机盐为基础，采用多种组合（表1）进行培养基优化，确定培养基各组分的最佳配比。

1.2.4发酵条件的优化。

以“1.2.3”优化后获得的发酵培养基，对多粘类芽孢杆菌DN-1发酵时间、温度、初始 pH、接种量等发酵条件进行优化。

发酵时间分别调为24、48、72、96、120 h；温度分别调为30、32、35、37、40 ℃；初始 pH分别设为 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0；接种量分别设为5%、7%、10%、12%、15%；测定产菌量和芽孢率，每处理4 次重复。

2结果与分析

2.1发酵培养基成分优化

5种碳源对DN-1菌株菌量和芽孢率具有显著影响（图1），以玉米粉的菌量和芽孢率最高，分别达 15.9亿/g、79%；稻壳和玉米粉的菌量、芽孢率均显著高于其他碳源。综合考虑生产成本，选择玉米粉和稻壳作为后续发酵碳源。

5种氮源对DN-1菌株产菌量和芽孢率影响不同（图2），其中酵母粉、茶渣饼、马铃薯显著高于其他氮源，以茶渣饼的菌量和芽孢率最高，分别达 17.4亿/g、84%；土豆的芽孢率高于酵母粉，但菌量两者差异不显著。为了降低生产成本，选择马铃薯和茶渣饼作为发酵的综合氮源。

5种无机盐对DN-1菌株产菌量和芽孢率影响也不同（图3），硫酸锰和磷酸二氢钾的菌量、芽孢率显著高于其他无机盐，其中磷酸二氢钾菌量达15.1亿/g；硫酸锰芽孢率达84%。因此，选择硫酸锰和磷酸二氢钾作为发酵用无机盐。

2.2多种组合培养基的优化

根据单因素试验结果，选择稻壳、玉米粉、硫酸锰、茶渣饼、马铃薯、硫酸锰、磷酸二氢钾进行多种培养基组合试验，分别以菌量和芽孢率为指标，确定发酵培养基成分的最佳配比。由表2可知，处理1培养基组合为最佳水平，菌量和和芽孢率均显著高于其他组合，分别达26.3亿/g、92%。因此，确定DN-1菌株最佳发酵培养基成分为15%稻壳、40%玉米粉、20%马铃薯、10%茶渣饼、15%水、0.1%磷酸氢二钾、0.2%硫酸锰。

2.3发酵条件的优化

时间显著影响DN-1菌株的菌量和芽孢率（图4）。随着发酵时间的增加，菌量和芽孢率逐渐提高，72 h时菌量达到高峰值，分别为24.9亿/g、91%，后续至120 h菌量呈稳定趋势，芽孢率开始下降。因此，确定72 h为DN-1菌株最佳发酵时间。

温度对DN-1菌株的菌量和芽孢率具有显著影响（图5）。随着发酵温度的上升，菌量和芽孢率逐渐提高，37 ℃时菌量达到高峰值（25.7亿/g），35 ℃时芽孢率最高达89%，但与37 ℃（芽孢率90%）相比差异不显著。因此，确定37 ℃为DN-1菌株最佳发酵温度。

初始pH 6.0～8.0 时DN-1菌株均可大量生长，在 pH 6.5～7.0时菌量和芽孢率较高，最高值分别达26.5亿/g、94%（图6）。pH 8.0时菌量和芽孢率都开始下降，说明弱酸条件有利于菌体生长和芽孢率的提高。因此，确定发酵培养基的初始 pH为6.5～7.0。

接种量对DN-1菌株的菌量和芽孢率也具有一定影响（图7）。随着接种量的增加，菌量逐渐增加，同时芽孢率也逐渐提高，当接种量为10%时，菌量和芽孢率最高值分别达26.3亿/g、92%；随后接种量继续增加，菌量和芽孢率略微下降。因此，确定最适接种量为10%。

3结论与讨论

试验以菌量和芽孢率为指标，对多粘类芽孢杆菌DN-1的固态发酵工艺进行优化，最终确定最适培养基配比为15%稻壳、40%玉米粉、20%马铃薯、10%茶渣饼、15%水、0.1%磷酸氢二钾、0.2%硫酸锰，最适发酵条件为发酵时间72 h，发酵温度37 ℃，初始pH 6.5～7.0，接种量10%。

试验发现，DN-1菌株对玉米粉和稻壳利用显著高于其他碳源，稻壳的空隙可能为菌体发酵提供必要的通气量，马铃薯和茶渣饼的组合氮源、锰离子更有利于提高菌量和芽孢率，目前多粘类芽孢杆菌固态发酵培养基中加入錳离子的报道较少。DN-1菌株在72 h时菌量和芽孢率达到高峰，而后续芽孢率开始下降，说明芽孢随着发酵时间的延长开始逐步转化为菌体。温度在 37 ℃以上时菌量和芽孢率开始下降，说明该菌株发酵温度不应高于40 ℃。最适初始pH为6.5～

7.0，可能弱酸条件有利于菌体生长和芽孢率的提高。多粘

类芽孢杆菌DN-1其他同类菌株发酵条件不同，它们之间

的差距可能由菌株本身的特性决定的，所以针对不同的菌株

应选择最适的培养条件。

研究多粘类芽孢杆菌固态发酵工艺等具有十分重要的意义，可为与井冈霉素A复配加工成可湿性粉剂提供技术支持。发酵过程是一个动态变化的过程，该研究对发酵条件的筛选只涉及室内中试条件，所得数据只能作为实际生产参考，规模化生产还必须进行工业化生产工艺的研究。

参考文献

[1] WANG Z W，LIU X L.Medium optimization for antifungal active substances production from a newly isolated Paenibacillus sp.using response surface methodology[J].Bioresource technology，2008，99（17）：8245-8251.

[2] 趙新海，钟丽娟，徐冲，等.康地蕾得对黄瓜枯萎病的室内毒力测定及田间防效试验[J].农药，2008，47（9）：696-698.

[3] 魏鸿刚，李淑兰.防治作物青枯病和枯萎病的微生物农药——0.1亿cfu/g多粘类芽孢杆菌细粒剂[J].世界农药，2008，30（1）：52-53.

[4] 郭芳芳，谢镇，卢鹏，等.一株多粘类芽孢杆菌的鉴定及其生防促生效果初步测定[J].中国生物防治学报，2014，30（4）：489-496.

[5] 章四平，刘圣明，王建新，等.枯草芽孢杆菌生防菌株 NJ-18 的发酵条件优化[J].南京农业大学学报，2010，33（2）：58-62.

[6] 方传记，陆兆新，孙力军，等.淀粉液化芽孢杆菌抗菌脂肽发酵培养基及发酵条件的优化[J].中国农业科学，2008，41（2）：533-539.

[7] 李文鹏，蔡磊，毕廷菊，等.胨冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）的分离、筛选及其发酵培养基研究[J].土壤通报，2001，32（2）：70-72.

[8] 纪明山，王毅婧.地衣芽孢杆菌生防菌株 SDYT-79 发酵条件优化[J].沈阳农业大学学报，2011，42（2）：164-169.

[9] 张文芝，王云鹏，刘红霞，等.蜡质芽孢杆菌 AR156 发酵培养基及发酵条件的优化[J].微生物学通报，2010，37（6）：803-810.

[10] 宫宇飞，乔红萍，魏国荣，等.内生枯草芽孢杆菌 E1R-J 发酵条件的优化[J].西北农业学报，2008，17（1）：61-64.

[11] 王哲，曹成亮，左飞，等.杨树变色真菌生防细菌 KLBMP 033发酵条件优化[J].林业实用技术，2011（11）：3-7.

[12] 周青，王笑，苏婷，等.青枯病和根腫病生防细菌 BS2004的发酵培养基和培养条件优化[J].中国生物防治学报，2012，28（4）：537-544.