东方百合脱毒技术规程
2017-05-30邵小斌孙明伟赵统利朱朋波汤雪燕王江英
邵小斌 孙明伟 赵统利 朱朋波 汤雪燕 王江英
摘要介绍了通过鳞片诱导胚性愈伤并培养成组培球，剥取百合组培球茎尖并诱导胚性愈伤及培养成球等方式的培养，最终脱除百合主要病毒，以获取百合无毒种源的过程，为生产无病毒的百合商业种球提供依据。
关键词百合；脱毒；技术规程
中图分类号S682.2+65文献标识码A文章编号0517-6611（2017）09-0132-02
Technique Criterion for Virus Elimination of Oriental Lily
SHAO Xiaobin，SUN Mingwei，ZHAO Tongli et al
（Lianyungang City Academy of Agricultural Sciences，Lianyungang，Jiangsu 222006）
AbstractThis article introduced the process of embryonic callus induction， training into tissue culture bulbs， stripping lily corm，culturing into tissue culture bulbs and so on， to remove lily main virus and get the lily nontoxic provenance. This study provides a basis for producing the commercial lily bulbs.
Key wordsLily；Virus elimination；Technique criterion
東方百合是利用天香百合（Lilium auratum）的花型和药百合（L.speciosum）的深红、深粉、粉色等艳丽的花色及其芳香宜人的遗传特性，培育出的东方百合杂种（L.tenuifolium oriental hybrid）群[1]。东方百合颜色丰富，花型大，深受人们喜爱，主要通过鳞片扦插等无性繁殖，但长期的无性繁殖过程中体内逐渐积累大量病毒，致使植株发生病毒病[2]。病毒病是影响百合切花和种球产量与质量的关键因素之一[3]，黄瓜花叶病毒（CMV）、百合无症病毒（LSV）、百合斑驳病毒（LMoV）等是感染东方百合主要病毒[4-5]，通常会导致花卉品种退化，品质趋差，经济价值降低[6]。针对目前生产现状，为了促进东方百合种球国产化，在大量试验的基础上，建立了东方百合脱毒技术规程。
1范围
该标准规定了东方百合脱毒技术。
该标准适用于江苏省地区具备生物技术条件下的东方百合脫毒技术。
2规范性引用文件
下列文中的条款通过该标准的应用是必不可少的。凡是注日期的版本适用于该文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于该标准。
NY/T 402 化学试剂 脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程；
NY/T 1491 花卉植物病毒检测规程；
NY/T 1840 植物病毒免疫电镜检测方法 ；
NY/T 2306—2013 花卉种苗组培快繁技术规程。
3术语和定义
下列术语和定义适用于该标准。
3.1东方百合
由天香百合、鹿子百合、日本百合、红花百合等种与湖北百合的杂种中选育出来的栽培杂种系。
3.2外植体
从活植物体上切取下来以进行培养的器官、组织或细胞、原生质体。
3.3胚性愈伤
具有产生胚状体能力的愈伤。
3.4茎尖
茎的顶端分生组织及其周缘部分。
3.5脱毒
利用剥茎尖、胚性愈伤等脱毒技术，脱去主要危害百合的病毒病及类病毒病。
3.6病毒病
由病毒侵入百合植株引起的，呈现叶脉退绿、花叶、黄斑、叶或花畸形等症状，造成植株生活力减弱、长势低下等现象的病害。
3.7培养基
供植物外植体存活和生长所必需的介质，通常由水、无机盐、有机物质、凝固剂、糖以及植物生长调节物质等组成。
3.8生根培养
把无根的幼苗转接到生根培养基中诱导生根，培养成生根苗的过程。
4生产设备（施）及化学试剂
4.1组培场地建设
组培实验室须选择安静、清洁、无污染的地方。
4.2洗涤设备
工厂化生产可选用自动洗瓶机，另外配置干燥箱、晾瓶架等。
4.3百合脱除病毒设备
超净工作台、培养箱、解剖刀、镊子、解剖针、解剖镜等。
4.4灭菌设备
高压蒸汽灭菌锅、器械消毒器、紫外灯、烘干箱、微滤孔器等。
4.5灭菌剂
选用乙醇、氯化汞、次氯酸钠、高锰酸钾、甲醛、84消毒液等。
4.6培养基及植物生长调节剂
MS培养基、6-BA、IBA、NAA、Picloram、蔗糖、琼脂等。
4.7病毒检测设备
PCR仪、凝胶成像系统、低温高速离心机、冰箱、制冰机等。
4.8培养基配制
按NY/T 2306—2013花卉种苗组培快繁技术规程要求，进行培养基配制。
5组培室消毒灭菌
每天用84消毒液稀释至1 000倍或75%乙醇喷洒洗涤组培室地面，保持室内清洁。接种室接种前用紫外灯照射20～30 min，并每30 d用高锰酸钾及甲醛混合熏蒸。培养室每60 d用高锰酸钾及甲醛混合熏蒸灭菌，工作期间用75%乙醇每3 d喷雾消毒。超净工作台接种前用紫外灯照射20～30 min，并用75%乙醇擦拭台面及内壁，并定期清洗超净工作台过滤膜以保证清洁。培养基用高温高压蒸汽灭菌，通常在压力102 kPa、温度121 ℃条件下保持，污染的瓶苗用消毒锅高温高压灭菌，然后再清洗培养容器。
6脱毒技术
6.1鳞片诱导成球
6.1.1鳞片选取。
选取完整无病虫害且周径≥14 cm的百合鳞茎，去除外层带病斑的鳞片，由外向内完整地剥取中层鳞片，流水冲洗净表面泥垢后，用0.2%～0.5%的洗衣粉水冲洗10 min，在流水条件下冲洗30 min。
6.1.2
鳞片消毒。
用75%乙醇灭菌30 s，再用0.1%的升汞溶液浸泡8～10 min，期间不断进行摇动，使鳞片充分与溶液混合，最后用无菌水冲洗5～6次。沿鳞片切除周围1 mm的外围部分，然后选取外层下部与鳞茎盘相连的部分为最佳外植体，横切约为0.5 cm厚的小块。
6.1.3愈伤诱导。
6.1.3.1愈伤培养基配方。
MS+6-BA 2.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L+蔗糖30.0 g/L+琼脂6.5 g/L，pH 5.8～6.0。
6.1.3.2鳞片接种。
将准备好的百合鳞片，底部带伤口面平放于诱导愈伤培养基上。
6.1.3.3培养条件。
将接种好的组培瓶放置于培养室中，置于23～27 ℃，暗培养45 d，鳞片顶部伤口处即形成淡黄色的愈伤。在培养期间，每隔20 d更换1次培养基。
6.1.4愈伤诱导成球。
6.1.4.1成球培养基配方。
MS+6-BA 0.5 mg/L+蔗糖150 g/L+琼脂6.5 g/L，pH 5.8～6.0。
6.1.4.2小鳞茎长成。将愈伤组织转移到成球培养基上，25～35 d后，分化出许多大小不等的鳞茎，将分化的小鳞茎接种到MS+IBA 1.0 mg/L+蔗糖60.0 g/L+琼脂6.5 g/L培养基上暗培养45 d，待鳞茎直径长到大于0.5 cm，取出备用。
6.2低溫处理打破休眠
将长成的组培鳞茎，整瓶转至4 ℃暗培养的冷藏室内，暗培养60～80 d解除休眠。
6.3热处理
將解除休眠的百合鳞茎，整瓶置于人工气候箱中，每天升高1 ℃，至变温光暗培养（白天 38 ℃、10 h，夜间 30 ℃、14 h）持续15～25 d。
6.4剥取茎尖
把热处理过的百合组培鳞茎，在超净工作台内取出无菌的组培鳞茎，在10～80倍的解剖镜下，用解剖刀剥除外部鳞片，露出生长点，用解剖针挑取0.5～0.8 mm大小的茎尖生长点接种到诱导愈伤培养基（MS+Picloram 25 mg/L+蔗糖30.0 g/L+琼脂6.5 g/L，pH 5.8～6.0）上，在25 ℃条件下，暗培养60～80 d，每20 d更换1次培养基。
6.5愈伤诱导成球
再次将茎尖诱导的胚性愈伤，放置于成球培养基上培养。25～35 d后，分化出许多大小不等的鳞茎，将分化的小鳞茎接种到MS+IBA 1.0 mg/L+蔗糖60.0 g/L+琼脂6.5 g/L培养基上，暗培养45 d，待鳞茎直径长到大于0.5 cm，取出备用。
7病毒检测
将通过茎尖最终诱导成球的百合组培鳞茎，采用多重RT-PCR法进行百合主要病毒，如黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、百合无症病毒（Lily symptomless virus，LSV）和百合斑驳病毒（Lily mosettle virus，LMoV）的检测，检测结果为阴性，说明组培鳞茎不带病毒可作为百合无病毒种源继续扩繁，如果为阳性，说明脱毒不够彻底，不能作为百合无病毒种源。
参考文献
[1] 钟海丰，黄宇翔，邓朝生，等.东方百合快繁培养基优化与脱毒技术研究[J].中国农学通报，2009，25（17）：168-173.
[2] 王小菁，陈刚，李明军，等.植物生长调节剂在植物组织培养中的应用[M].北京：化学工业出版社，2002：11-12.
[3] 陈进，李晓昕，袁雪，等.百合三种主要病毒的 RT-PCR 检测及脱毒技术研究[J].农业生物技术学报，2013，21（4）：489-497.
[4] 柯昉，陈华，黄宇翔，等.东方百合花器离体培养和快速繁殖研究[J].仲恺农业技术学院学报，2005，18（1）：14-17.
[5] 王继华，唐开学，张仲凯，等.百合病毒及脱毒检测进展[J].北方园艺，2004（6）：73-75.
[6] 高慧卿，樊兰瑛，王秀红，等.茎尖培养及热处理技术在百合脱毒中的应用研究[J].山西农业大学学报（自然科学版），2010，30（6）：528-532.
