聚合酶链式反应技术在食品源性分析中的应用

姚艳玲

摘要[目的]比较不同聚合酶链式反应（PCR）技术在食品源性分析中的应用，分析引物、荧光染料和探针的特点及其发展前景。[方法]介绍PCR、荧光定量PCR技术，比较该技术及荧光标记基团的特性，及其在食品源性成分鉴定方面的实际应用。[结果]通过完善DNA提取方法、优化反应体系、设计特异性引物或探针均能有效提高PCR检测的灵敏度及准确性。[结论]采用PCR、荧光定量PCR技术能有效地实现食品中源性成分鉴定，且方法具有高灵敏度、高特异性、高效率等优势，能满足实验室对食品中源性成分的检测分析。

关键词聚合酶链式反应；荧光定量聚合酶链式反应；源性成分

中图分类号TS207.3文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）09-0098-03

Application of Polymerase Chain Reaction in Food Derived Materials Determination

YAO Yanling

（Jiaxing Testing Institute for Food and Drug Control，Jiaxing，Zhejiang 314001）

Abstract[Objective] The application of different polymerase chain reactions（PCRs） in food derived materials′ determination were compared，in order to analyze the diversification and prospect of the primer，dye and probe in PCR.[Method] The techniques of PCR and fluorogenic quantitative PCR were introduced，and the characters and the applications of these techniques in the determination of food derived materials were compared.[Result] The sensitivity and availability of the technology of PCR can be improved by improving extraction methods of DNA，optimizing the reaction systems，and designing the distinct primes or probes.[Conclusion] The technologies of PCR and fluorogenic quantitative PCR can be used in the determinations of food derived materials，and they have the characteristics of sensitive，efficient and specific.

Key wordsPolymerase chain reaction；Fluorogenic quantitative PCR；Derived materials

近年来，食品中掺假、造假事件屡见不鲜，以鸭肉代替牛羊肉，用果葡糖浆充当蜂蜜，以海藻酸钠、明矾、明胶等为主要原料制作的假鸡蛋，用地沟油代替食用植物油等事件屡遭曝光，却屡禁不止。为了追求更高的商业利益，制造商不惜铤而走险，不仅破坏了市场消费信誉，降低了人们对食品安全的信心，很大程度上也增加了食品安全监管的压力。目前，对掺假食品的检验方法还不尽完善，甚至还有缺失。

对于物种源性鉴别常采用感官检验和免疫学方法，但肉奶制品经热加工处理，导致其感官性状、蛋白质成分和其他免疫原性物质被破坏而难以鉴别[1]，而聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术刚好可以弥补这个缺陷。正确选择物种的特异性基因进行源性成分鉴定，不受食品深加工工艺的影响，大大提高了检测的准确性和有效性。PCR技术早在1985年由科学家Kary Mullis和Cetus研究发明，是最基本的扩增DNA或增加样品中特殊核苷酸片段数量的方法[2]，它可看作是模拟体内DNA复制的原理在体外酶促合成特异DNA片段[3] ，在短时间内使微量DNA呈指数型增长，从而达到检测目的。该技术快速准确、灵敏度高，已被广泛应用于食品源性分析的研究中，为完善食品源性成分鉴定检验的标准体系积累了一定的技术基础。

1PCR技术

1.1PCR反应体系

PCR技术是對特定核苷酸片断进行指数级扩增，在扩增反应结束之后，通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性或定量分析，进而对产物进行测序比对。该方法迅速发展和广泛应用源于反应体系的建立，PCR反应体系主要包括缓冲液、氯化镁溶液、dNTP、Taq DNA聚合酶（Taq DNA Polymerase）、引物和DNA模板等。其中的Taq酶具有热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持較高的活性，促进体外扩增有效进行，大大提高了扩增的效率，使PCR技术得到快速发展。反应体系中的特异性引物是目标DNA扩增的直接影响因子，通常试验者利用软件进行引物设计。目前常用的引物设计软件有Premier Primer、Oligo 6、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga和Dnastar等，这些软件都带有引物自动搜索功能，同时结合人工分析便能更有效地设计特异性引物。除了引物和Taq酶以外，dNTP、DNA模板和Mg2+的含量均会影响扩增结果。因此，在建立PCR反应体系时，可以通过优化各反应条件，以得到更高的灵敏度和准确性。

1.2荧光定量 PCR

荧光定量 PCR是在普通PCR的基础上发展起来的分析方法，该方法在反应体系中加入荧光染料或探针等荧光物质，通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物的荧光信号进行实时检测，实现对起始模板定量及定性分析。根据荧光化学模式不同，可分为荧光染料法和荧光探针法，常见的荧光标记基团的特性见表1。

SYBR Green I是应用最广泛的一种荧光染料，能结合所有DNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强，而未结合的染料不能发射荧光信号。但是，在做染料法荧光定量PCR时，要注意区分假阳性现象，非特异性扩增和引物二聚体均能结合SYBR Green I而干扰检验结果。目前的荧光染料除了SYBR Green I以外，还有LC Green TM1和Pico Green等新型荧光染料[4]。

目前应用最广泛的荧光探针是TaqMan水解探针，探针上5′端和3′端分别标记了1个报告荧光基团和1个淬灭荧光基团。在反应初始时，系统激发供体而产生的荧光信号被

邻近的淬灭基团吸收，所以此时检测不到供体荧光信号；而

当PCR过程中聚合酶扩增到探针结合模版的位点时，其5′～3′核酸外切酶酶切探针5′端的报告基团，此时游离的报告基团远离淬灭基团，产生荧光信号而被检测到。该水解探针法中，一旦报告基团水解离开淬灭基团，就一直游离于反应体系中可被检测，所以检测的是累积荧光，信号不可逆。而杂交探针FRET不同，上游探针的3′端和下游探针的5′端分别标记供体荧光基团和受体荧光基团，复性时2条特异性探针杂交到模板上，相互靠近而产生荧光信号；升温变性时2条特异性探针又远离模板，此时供体和受体荧光基团分开，荧光信号消失，所以利用该法检测到的是实时信号，而非累积信号，信号可逆。除了以上两者以外，荧光探针还有TaqMan MGB探针、分子信标等[5]。

2PCR在物种源性成分鉴定方面的应用

2.1利用PCR进行物种源性成分分析

动物源性分析时主要针对其各自线粒体基因保守序列设计引物，优化反应体系，建立分析方法。于卫霞等[6]利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术对鱼种进行鉴定。试验人员从基因库中找到8种海鱼以及其他12种参照海鱼鱼种的线粒体细胞色素C氧化酶亚基III基因（MT-co3），通过比对分析自行设计通用引物进行DNA扩增，对扩增产物进行克隆、测序，然后根据生物信息软件提供的限制性内切酶酶切信息，筛选出Nla III和Hinf I 2种内切酶组合体系，对10种海鱼的PCR产物进行酶切分析，获得了各种鱼类特异的酶切片段图谱。试验结果表明，引物MT-co3对10种海洋鱼的通用性较高，经测序分析发现，选用MT-co3基因作为分子标记鉴定的鱼种与形态学鉴定的鱼种相似度不低于99%，同时试验获得了基因库中未找到的另外2种海鱼的MT-co3全序列。通过酶切图谱分析，使用单一的Hinf I或Nla III酶切都不能将10种海鱼进行区分，但依次使用Hinf I或Nla III 2种酶酶切，可将这10种海鱼进行有效区分。该试验方法首次采用MT-co3基因作为分子标记，采用PCR技术进行鱼类种属的鉴别，结合适宜的限制性内切酶酶切分析技术，可对10种海鱼进行种源性鉴别。

尚柯等[7]通过在基因库中分析和比对猪、牛、羊的线粒体基因保守序列，确定了针对不同物种线粒体cyt-b基因中的特定片段，分别设计相同的上游引物和具有各自物种特异性的下游引物。通过多次优化反应体系及引物配比，确定多重PCR试验条件，所扩增得到的猪、牛、羊的基因片段大小分别为384、258和318 bp，通过基因片段大小差异对样品肉的源性进行鉴定。同时，他们还进行了检测限试验，通过设定不同的模板比例，最终确定该多重PCR体系对猪牛肉、猪羊肉混合样品的最低检测限可达10%。该研究确定了针对以上3种动物的共同序列及其特异性序列，建立了这3类常见畜肉的特异性检测引物体系，能有效进行猪、牛、羊源性分析。

曲莉等[8]采用改良盐析法和柱层析法有效提取鸭肉、鸡肉、猪肉、牛肉、羊肉、马肉和驴肉的mtDNA，通过在GenBank中下载绿头鸭线粒体细胞色素b（AY676201.1）基因序列，进行引物设计，通过反复梯度PCR试验，确定最佳退火温度为62 ℃；同时，以提取的7种肉类mtDNA为模板，验证所设计的鸭肉引物的特异性。结果表明，设计的引物仅在鸭肉模板上有明显扩增，扩增产物大小为223 bp。该研究改良了2种DNA提取方法，采用PCR技术对肉类产品中的鸭源性成分进行鉴定，比起商品化试剂盒的提取更能缩短提取时间、降低试验成本。

国外在这方面的研究比国内开展得更早，如Tartaglia等[9]根据牛线粒体DNA中的特异性序列设计引物，通过试验后建立了适用于饲料中牛源性成分的检测方法，该方法灵敏度可达0.125%。Arslan等[10]以经烹饪、蒸烤、压力等处理过的牛肉制品为研究对象，经试验证明经水烹饪过后的牛肉制品仍可提取其线粒体DNA片段，后经PCR扩增可以对其牛源性成分进行鉴别，因此以牛线粒体DNA为模板，采用PCR技术可以对经水烹饪后的牛肉制品进行牛源性分析。

綜上所述，采用PCR技术可对鱼类、畜肉、禽肉、熟肉制品和饲料等进行肉源性分析，方法检出限、靈敏度均能满足要求。但该方法后续均需进行凝胶电泳，并对电泳结果进行成像分析，使用试剂多、耗时长，不能实时检测，对日常监督检验要求来说显得较为冗长滞后。

2.2利用荧光定量PCR进行物种源性成分分析荧光定量PCR主要采用荧光染料或者标记各种不同荧光基团及荧光淬灭基团的探针来实现实时荧光检测。

杨丽霞等[11]根据鸭线粒体基因序列的位点差异设计特异性引物，采用SYBR Green I染料，通过溶解曲线分析，建立荧光定量PCR检测方法。试验以鸭肉、牛肉混合样品为试验对象，结果表明，试验针对鸭线粒体基因设计的引物特异性较好，扩增试验中仅鸭线粒体DNA有扩增，其Ct值为12.82，而牛线粒体DNA未扩增；鸭基因组检测灵敏度为1 pg DNA；溶解曲线试验显示，鸭DNA扩增产物的溶解温度为79.15 ℃，可以有效区分目的片段、非特异性扩增和引物二聚体。试验将牛肉、鸭肉以9∶1的比例混合后在100 ℃加热15 min，采用试验中建立的方法进行检测，鸭肉DNA扩增Ct值为26.99，产物溶解温度亦为79.15 ℃，说明该方法也适用于熟鸭肉的检测，灵敏度及特异性均可满足实验室鸭肉源性成分鉴定。

趙冉[12] 选取GenBank上已发表的猪、牛源性mtDNA D-loop序列，在NCBI中进行比对后，分别针对猪、牛线粒体DNA种间保守基因，设计特异性引物与TaqMan探针、猪探针报告荧光基团ROX、荧光淬灭基团BHQ2；牛探针报告荧光基团HEX、荧光淬灭基团BHQ1。通过对反应体系和反应条件的优化筛选，利用以上2种发射波长相差较大的报告荧光基团，在ROX、HEX荧光通道搜集信号，建立了猪、牛双重荧光PCR检测方法。试验通过对16种不同来源的动物源性核酸进行检测，确定该方法所设计的猪牛引物的特异性，同时对猪、牛DNA模板进行梯度稀释，确定其方法最低检出限均达10-5。试验对不同状态的样品进行检测，结果显示，建立的双重荧光PCR法还适用于蒸煮、腌制肉制品、动物血液、奶制品及饲料中猪牛源性分析检测。

史艳宇等[13]以鸭线粒体基因全序列为靶位点设计引物和探针，经Blast软件对相似序列搜索后，筛选出最优且与常见畜禽肉无交叉反应的引物及探针，所用到的探针为TaqMan水解探針，报告荧光基团FAM，荧光淬灭基团TAMRA，采用荧光定量PCR仪进行检测。试验分别用羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉、猪肉、兔肉、马肉和鹿肉等对引物进行特异性试验，同时，用羊肉DNA溶液对鸭肉DNA进行梯度稀释，再进行鸭肉检测灵敏度试验。通过优化PCR反应体系，最终建立了鸭源性成分检测方法，该方法具有较强特异性，所设计的引物及探针对鸭肉的检测灵敏度可达0.1 μg/kg，并且高浓度羊肉成分的存在对鸭肉灵敏度检测没有影响。

范丽丽等[14]以鸡线粒体细胞色素b为目的基因，设计特异性引物和TaqMan水解探针，探针的报告荧光基团FAM，荧光淬灭基团TAMRA。利用所设计的特异性引物对鸡DNA模板进行扩增，所得产物片段为110 bp。在特异性试验中，试验人员将鸡、猪、牛、羊、鸭、火鸡、鹌鹑和鸽子等DNA模板进行PCR反应，结果显示设计的引物探针体系只对鸡DNA模板进行扩增，Ct值为35，其他源性成分均未有效扩增；灵敏度试验显示该方法最低可检测3.5 pg/μL鸡肉DNA，可用于对食品中鸡源性成分的掺假鉴别。

综上，荧光定量PCR目前较常用的荧光基团较集中于SYBR Green I和TaqMan探针，SYBR Green I信号可逆，利用该特性结合溶解曲线分析可实现多重检测；TaqMan探针上标记的荧光报告基团和淬灭基团可根据检测通道不同分别进行设计，在同一反应体系中加入标记不同荧光基团的探针也可实现多通道检测，因此在荧光定量PCR检测时，引物及探针的设计至关重要，在今后的工作中有待更深入的探索试验。在已发表的文献中，利用双杂交探针FRET、分子信标及LUX引物在源性鉴定分析方面应用还较少。使用杂交探针在探针合成时标记较为复杂，且杂交时探针不能完全与模板结合，稳定性较差；而LUX引物在合成时不需要专门设计探针，其特异性要弱于探针技术，但非特异性扩增或引物二聚体没有影响，其特异性又优于SYBR Green I。鉴于各染料、探针及引物的特性不同，在食品源性成分分析鉴定方面的应用还有待更深入的研究与探索。

安徽农业科学2017年

3前景与展望

利用PCR、荧光定量PCR技术，从分子角度进行物种源性分析检测，是当前食品安全检测的新兴行业，近年来发展尤为迅速。PCR技术在源性成分分析时，针对目标DNA设计特异性引物以实现DNA模板的扩增；多重检测时，通过设计通用性的上游引物及特异性的下游引物，或在同一反应体系中设计各自不同的上下游引物，以实现物种鉴定的多重快速检测。荧光定量PCR技术以实时、快速、简捷的特性在食品源性成分鉴定方面也得到了迅速发展。除了嵌入式荧光染料的使用外， TaqMan探针的应用最为常见，利用标记不同的荧光报告基团及淬灭基团的TaqMan探针，可实现多通道实时检测。在荧光淬灭物质设计方面，有研究者利用一种单层的、二维的碳纳米材料——氧化石墨烯作为反应时的淬灭剂，该物质能吸附单链DNA，对标记在单链核酸上的荧光染料具有很强的淬灭作用[15]，这在荧光定量PCR技术应用方面又开拓了新的发展方向。由于目前检测仪器的通道限制，多通道检测目前多局限于双重或三重，在今后的研究工作中，随着荧光标记物质的不断开发，相应仪器的检测通道会不断增加，多重检测必将是PCR技术发展的主要方向。

食品源性成分检测方法的建立，通过改良DNA提取技术以提高目标DNA提取效率，采用限制性内切酶酶切技术以实现物种多态性分析，优化扩增反应体系及温度条件以提高检测灵敏度，设计不同引物、标记荧光基团的探针以提高检测专一性等，这些技术在一定程度上不断开发PCR技术的潜力，延伸其在物种鉴定方面的发展空间。今后，通过对双杂交探针FRET、分子信标及LUX引物等技术研究的不断深入，食品源性鉴定分析的方法必将朝着多元化的方向发展。

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