八角莲组织培养的器官发生途径研究

陈瑶 刁瑕 宦云敏 杜阳春 李维 何兵

摘要： 為探究小檗科植物八角莲组织培养的器官发生方式，该研究以八角莲离体叶片、叶柄在MS培养基上诱导产生的愈伤组织、不定芽、不定根为对象，用连续石蜡切片技术分析八角莲组织培养的器官发生途径。结果表明：八角莲愈伤组织形成的解剖学特征是靠近表皮的薄壁细胞经激素刺激恢复分裂能力，继续培养形成拟分生组织。拟分生组织可形成许多分化中心。通过对八角莲组织培养产生的不定芽细胞组织学观察发现芽原基起源于愈伤组织外侧的几层薄壁细胞，芽原基背离愈伤组织中央生长形成不定芽，故八角莲脱分化形成的芽起源方式为外起源。而八角莲的根原基起源于组织深处髓部薄壁细胞和部分维管形成层细胞，进而形成类似球形或楔形并朝韧皮部突起的根原基轮廓，根原基继续发育会突破表皮生成不定根，起源方式为内起源。八角莲离体再生途径为器官发生型，在组培苗生长过程中先诱导形成不定芽，再诱导形成不定根，在愈伤组织上形成维管组织将不定芽和不定根连接成完整植株。

关键词： 八角莲， 不定芽， 不定根， 组培苗， 石蜡切片

中图分类号： Q943.1， Q945文献标识码： A文章编号： 10003142（2017）09111111

Abstract： To study the organic regeneration pathway of tissue culture of Dysosma versipellis， we used callus， adventitious buds and roots induced from in vitro leaves and petioles of D. versipellis on MS medium to analyze it， based on the technique of serial paraffin slices. The results showed that the parenchyma cells which were near the epidermis recovered cell division ability through the hormone stimulation. Originally cells of the stationary state altered cell metabolism after they were stimulated， and cell division became active. The parenchyma cells were continued to culture and formed meristemoid with cells division potential of totipotency of plant cell， which could form a lot of differentiation centers. Histological observation of D. versipellis proved that the bud primodium derived from the subsurface layers of callus and grew away from the middle of callus， so the buds which produced by dedifferentiation originated in exogenous way， formed the adventitious buds. Furthermore， the root primodium originated from parenchyma cells in the pith and partial vascular cambium cells in the depth of tissue， which raised towards the phloem liked spherical or wedge. It would continue growing and break epidermis， then adventitious buds were formed. This way was endogenous. Organogenesis type was the conventional way for D. versipellis to regenerate in vitro. Adventitious buds were induced at first during the growth process of tissue culture seedling， which was followed by the formation of adventitious roots. Because of vascular bundle of adventitious roots being originated from callus must link vascular bundle of stem and branch， it played an important role in supporting small plant development. At last， the vascular bundle formed from callus would connect the two into a complete plant. The research result has important guiding significance for scale planting cultivation of D. versipellis while protecting of germplasm resources.

Key words： Dysosma versipellis， adventitious bud， adventitious root， tissue culture seedling， paraffin section

八角莲（Dysosma versipellis）又名旱八角、金魁莲是中国特有濒危保护植物，属于小檗科（Berberidaceae）鬼臼属（Dysosma），主要分布在浙江、湖南、湖北、云南、四川等地（中国植物志，2001）。八角莲药用价值高，能抑制多种细菌（Zheng et al，2016），治疗蛇毒咬伤、关节酸痛、半身不遂等疾病（中国植物志，2001）。八角莲的有效成分黄酮类化合物、鬼臼毒素等具有抗病毒、抗肿瘤等作用（陈日道等，2016），尤其用于治疗食道癌、子宫癌（Yuan et al，2011）、前列腺癌等（Jiang et al，2007）。近年来，适合八角莲生存的阴暗潮湿生境被强烈破坏，导致八角莲栖息地面积逐渐减小，野生八角莲分布地区和数量锐减，再加上人们长期对野生八角莲无规律采挖，最终导致野生八角莲资源濒于灭绝。因此必须尽快建立八角莲人工高效繁殖体系。

目前，八角莲的研究主要集中在其种质资源、化学成分、药用价值、离体快繁等方面。八角莲离体快繁是解决野生八角莲资源短缺的重要途径之一，很多学者就此进行了深入研究，并且取得了一定的成果，Jiang et al（2012）成功建立了八角莲再生体系。但已有研究都是从外植体选择、培养基种类、激素种类及其配比等方面入手，目前未發现有研究者对八角莲离体器官的形态发生途径进行研究。因此，本研究以八角莲叶柄、叶片为外植体进行组织培养，以获得组培苗。运用形态学观察和解剖学方法对八角莲组培苗器官发生途径进行研究，目的在于揭示八角莲离体培养器官发生途径和植株再生规律；探索八角莲植株高效再生的培养方式和培养条件；用于指导八角莲种苗生产；同时也为研究鬼臼属植物离体再生规律提供理论参考依据。

1材料与方法

1.1 实验时间、地点

实验于2015年10月至2016年6月在四川师范大学生命科学学院实验室进行。

1.1.1 材料本研究使用的外植体为八角莲离体叶片和叶柄，引种自四川省峨眉山，移栽在四川师范大学生命科学学院实验基地生物园中。

1.1.2 方法

1.1.2.1 八角莲组织培养八角莲组织培养分为三个步骤。第一，在培养基（A）中诱导外植体（叶柄、叶片）脱分化形成愈伤组织；第二，在培养基（B）中诱导愈伤组织再分化形成芽；第三，在生根培养基（C）中诱导芽生根（具体配方见表1）。培养条件：温度为（22±1）℃，光照时间为14 h·d1，湿度为75%，光照强度为1 000 lx。

1.1.2.2 形态学和解剖学观察从外植体接入培养基开始，每隔一周观察外植体形态变化。当愈伤组织产生时，取样做石蜡切片，直到形成完整植株。石蜡切片用番红-固绿染色，在Leica DM 3000显微镜下进行解剖学观察并拍照。

2结果与分析

2.1 诱导形成愈伤组织

2.1.1 八角莲愈伤组织形成的形态学观察外植体在培养基A中培养30～35 d，叶片明显增大并且边缘向上卷曲（图1：A），叶柄弯曲（图2：A）。延长培养到40～45 d，叶脉开始膨大、叶片增厚（图1：B）；叶柄切口处膨大（图2：B），表明此时细胞已开始增殖。培养到第55～65天可在叶片、叶柄切口处脱分化形成颗粒状、淡黄绿色的愈伤组织（图1：C；图2：C），但愈伤组织生长缓慢。继续培养，可产生一团淡绿色或淡黄色、有光泽的愈伤组织（图1：D；图2：D）。

2.1.2 八角莲愈伤组织形成的解剖学特征观察八角莲愈伤组织石蜡切片发现靠近表皮的薄壁细胞在激素刺激下逐渐脱分化恢复分裂能力，分裂产生的细胞体积小，细胞核染色较深，细胞无规则，细胞间隙大且缺少有组织的结构（图3：A）。继续培养，恢复分裂能力的细胞快速进行有丝分裂（图3：B），形成分生细胞团，分生细胞团内部细胞之间无间隙，细胞体积稍小，分生细胞团之间存在空泡状细胞（图3：C）。有的愈伤组织在激素刺激下产生拟分生组织（图3：D，E，F）。这些分生细胞团和拟分生组织对八角莲后期的器官形成和输导组织分化有重大作用。

分生细胞团中的部分细胞开始分化，细胞纵向生长，细胞侧壁不同程度加厚，原生质体分解，相邻细胞之间的细胞横壁溶解，最终分化形成导管（图4：A，B）；有些拟分生组织还会分化形成筛管，伴胞清晰可见（图4：C）。导管和筛管等输导组织对愈伤组织的水分和营养物质运输起重要作用。拟分生组织可形成许多分化中心，并且可在愈伤组织近表层形成芽原基。

2.2 诱导分化不定芽

2.2.1 八角莲不定芽形成的形态学观察将八角莲愈伤组织转接至培养基B中，培养25～30 d发现在呈块状、结构紧致，表面粗糙、颜色偏暗的愈伤组织块上很难诱导出不定芽，在呈淡黄绿色的颗粒状愈伤组织上才能诱导分化出不定芽（图5：A），延长培养，不定芽分化出叶片（图5：B），继续培养20 d左右可形成丛生芽（图5：C，D）。

2.2.2八角莲不定芽形成的解剖学特征愈伤组织转入诱导分化培养基（B）30 d后，每隔5 d取一次样做石蜡切片，连续做7次。在此过程中发现八角莲组织培养产生的芽原基起源于愈伤组织外侧的几层薄壁细胞，这些能够分化形成芽原基部位的愈伤组织最外层有一层表皮细胞。这层表皮细胞呈长方形，细胞排列紧密，无间隙。这层表皮细胞以内的几层细胞薄壁细胞进行垂周分裂，产生的细胞不规则，细胞体积小，但是细胞核明显，细胞排列紧密，无间隙。垂周分裂产生的细胞形成新的生长点，即原始芽原基（图6：A），原始芽原基的生长点背离愈伤组织中央，随着细胞加速分裂可形成明显的芽原基（图6：B，C）。这些芽原基在培养基（B）中培养会分化出不定芽。

不定芽在生长过程中会形成不同的形态。有的芽原基直接分裂分化形成融合的不定芽（图7：A）；有的不定芽的顶端分生组织直接向外生长（图7：B）；部分不定芽由两片叶原基保护着向外生长 （图7：C）；有的不定芽由封闭的叶原基包裹 （图7：D-a）；有的芽原基会形成酒杯状的不定芽（图7：D-b）；也有由叶原基保护的圆屋顶状的顶点分生的不定芽（图7：E）；有的芽原基形成具有多层幼叶的结构（图7：F）。由此可知八角莲愈伤组织分化形成的芽是不定芽，其起源方式为外起源，发生方式属于器官发生型。

虽然诱导分化的不定芽有不同的形态，但不定芽顶端分生区的细胞有相同的解剖学特点。其表皮层细胞近方形，细胞体积小，细胞壁薄，细胞核大，细胞质稠密，无液泡，细胞排列紧密，细胞之间的间隙小甚至无间隙。表皮层内的细胞近圆形，细胞核较大，细胞质稠密，细胞间略有间隙。但是随着细胞不断远离不定芽顶端分生组织，细胞核逐渐变小，细胞质减少，细胞间隙加大，细胞体积变大，达到一定程度后细胞不再变化（图8：A，B，C）。

在八角莲芽原基发育为不定芽的过程中，不定芽内的细胞逐渐分化形成螺纹状的筛管（图9：A，B，C，D），维管束（图9：E，F）。这些维管组织在不定芽生长过程中为其运输必需的水分和营养物质。

2.3 诱导八角莲不定芽生根

2.3.1八角莲不定芽生根的形态学观察丛生芽在培养基（C）中培养10 d左右，不定芽基部的愈伤组织上出现白色瘤状凸起（图10：A），继续培养8 d左右白色瘤状凸起发育形成不定根（图10：B，C），待根系继续生长5 d左右既可以进行移栽， 移栽后组培苗根系可正常生长。（图10：D）。

2.3.2不定芽生根过程的细胞组织学观察将2～3 cm高的不定芽接入生根培养基C中，每隔3 d取样做石蜡切片，共取5次样。观察大量石蜡切片发现愈伤组织深处的髓部薄壁细胞首先再分化产生新的薄壁细胞，新薄壁细胞构成维管形成层。维管形成细胞的细胞质浓、细胞核染色较深（图11：A）。薄壁细胞经过多次有丝分裂，形成层加宽，有些地方出现染色比其他区域稍深的细胞团。这些细胞团排列紧密，细胞体积小，细胞质浓，细胞核相对较大。这些细胞团具有强烈的分裂能力，可分裂分化形成类似球形或楔形并朝韧皮部突起的根原基轮廓，同时表皮细胞溶解。在后期的切片中可观察到原始根原基（图11：B），此生长点可形成根原基。根原基形成的顶端分生组织明显，细胞分裂能力旺盛，不断向外生长。中后部细胞染色变浅，分生能力减弱，逐渐变成薄壁细胞（图11：C），直到形成完整的不定根（图11：D）。根原基起始于愈伤组织深处的薄壁细胞，可见八角莲离体组织培养的根起源方式为内起源，生成的根为不定根。

不定根顶端分生组织的部分薄壁细胞可分化形成导管（图12：A-b，C），愈伤组织中的一些薄壁细胞也分化形成导管（圖12：A-a，B），并且与不定根中的导管相连。这些导管可以将愈伤组织中的水分运输到不定根中，为不定根的生长提供充足的水分和矿物质。在形成不定根的愈伤组织上还发现了更完整、更庞大的维管组织（图12：D，E，F，G，H，I），这些维管组织不仅与不定芽中的维管组织相连，还和不定根中的维管组织相连。这样不定芽与不定根就通过维管组织连接形成完整植株。这些维管组织不仅可以将愈伤组织中的营养物质运输到不定芽和不定根中去。还可将不定根从土壤里吸收的水分、无机盐等物质运输到植株的各个部位，从而提高八角莲组培苗移栽成活率。

3讨论与结论

植株离体再生途径包括体细胞胚发生途径和器官发生途径（薛银芳等，2012）。观察八角莲组培苗器官的形态学发育过程和各发育阶段解剖学特征可知：八角莲离体再生途径属于器官发生途径中的器官发生型，在激素的刺激下先以外起源的方式形成不定芽，再以内起源的方式形成不定根。在八角莲组织培养三个阶段中诱导外植体脱分化形成愈伤组织需要70 d左右，愈伤组织形成后增殖缓慢。愈伤组织再分化形成不定芽需30 d左右，继续培养20 d左右可形成大量丛生芽，并在其内部产生大量维管组织，为后期组培苗运输水分和营养物质奠定基础。不定芽生根过程仅需要15 d左右。在八角莲规模化的生产中建议先在分化培养基（B）中大量诱导形成丛生芽，再诱导丛生芽生根，此方法可节约种苗生产时间。不定根形成后应在生根培养基（C）中继续培养5 d左右，以便不定根中的输导组织和不定芽中的输导组织连接成一个整体，从而提高组培苗移栽成活率。在实验中还发现板结致密的愈伤组织不易诱导形成不定芽，在后期实验中应调节生长素、细胞分裂素的种类及使用比例，以诱导形成淡黄绿色的颗粒状胚性愈伤组织，以便更好更快地诱导形成不定芽。

3.1 不定芽发生途径

根据解剖学研究分析可得出八角莲愈伤组织再分化途径为器官发生途径：即在愈伤组织不同部位分别形成不定芽、不定根，然后不定芽和不定根通过维管组织连接形成完整组织。这与亚洲百合的花丝离体再生途径相似（姚绍嫦等，2009）。关于体细胞脱分化形成的拟分生组织先发育形成芽原基，随后再形成叶原基；还是先形成叶原基后再形成芽原基；或者芽原基和叶原基同时形成等问题存在争议（蔡润等，2002；Bowman & Eshd，2000；Barton & Poething，1993）。由图6：A，B，C可知八角莲离体植株再生是先形成芽原基，芽原基发育为不定芽时会有叶原基形成（图7：C，Da，E，F），但并非所有不定芽都伴有叶原基（图7：A，B，Db）。

3.2 不定根发生途径

根原基产生部位常有形成层、皮层薄壁细胞、韧皮部、髓射线细胞、愈伤组织（Fahn，1997），并分为潜伏根原基和诱生根原基（Davis，1994）。通过对八角莲不定根发生过程的解剖学研究发现，八角莲愈伤组织中无潜伏根原基存在，形成不定根的诱生根原基是在生长素IBA诱导下才形成。生长素IBA在诱导不定根形成中起着重要作用，如铁棒锤（陈红刚等，2016）、金铁锁（李斌等，2016）不定根的形成都与IBA密切相关。八角莲组培苗不定根的根原基起源于愈伤组织深处的髓部薄壁细胞。这些细胞分裂分化形成类似球形或楔形并朝韧皮部突起的根原基轮廓、根原基、最终形成不定根。李志军和于军（2002）发现田旋花不定根起源于维管形成细胞。于宏等（2008）研究表明珍稀药用植物杏香兔耳风组培苗的根原基源于髓射线分生细胞，也属于诱导根原基。其根系发育过程可分为髓射线分生细胞分化、形成根原基、形成不定根三个阶段。紫花含笑组培苗在诱导生根前不含根原始体，根原基起始于髓射线与形成层交接处的薄壁细胞（宋晓琛等，2014）。本研究结果表明八角莲组培苗生根过程还与油茶（吴幼媚等，2013）、铁线莲（张启香等，2010）等组培苗形成不定根的过程相似。

Salaj et al（2005）发现亚麻愈伤组织中的分生结节在合適的培养条件下可直接形成器官，也可以诱导形成体细胞胚。吴泽等（2014）发现百合的胚性愈伤组织上的分生结节就可发育为体细胞胚。在八角莲离体器官发生过程中发现愈伤组织中存在分生结节，在后期的研究中可进行相关研究。

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