几种因素对纸荚豆不定根生长的影响研究

刘懿萱，徐亚男，金美玉，朴炫春，廉美兰

(延边大学 农学院，吉林 延吉 133002)

纸荚豆(Sutherlandiafrutescens(L.)R.Br.)属豆科多年生灌木植物[1]，产于非洲南部炎热干旱的地区，其全株富含松醇、黄酮、多糖、三萜皂苷等多种活性物质[2-4]，具有抑菌、抗氧化、抗炎、抗病毒和抗肿瘤等药理活性，整株皆可入药[5-7]。然而，由于人为过度采集导致纸荚豆自然种群数量不断下降，加上种子发芽率低等原因导致纸荚豆人工栽培困难，使纸荚豆植物材料满足不了其产品生产的需求，因此早期有学者尝试利用生物反应器来大量培养无菌苗，但发现其玻璃化现象严重[8]，至今未见此培养体系为人工栽培提供优良种苗的报道。

植物不定根培养是一种可在短期内大量获得植物材料，生产有效代谢产物的方法[9-11]。目前，此技术已在东北刺人参[12]、何首乌[13]、贯叶连翘[14]等多种药用植物上得到了应用，但纸荚豆不定根培养的研究至今尚未见报道。植物生长调节剂对离体培养的植物细胞或器官生长起着重要的作用[15]。在不定根培养中，往往通过在培养基中添加生长调节剂来诱导不定根并提高增殖效率，且有前人研究表明，适宜浓度的吲哚丁酸(IBA)能够有效促进植物生根发育[16-18]。碳源是植物生长发育的能源物质，而且影响着代谢产物的积累[19-20]；蔗糖相比于其他碳源物质稳定性高，价格低廉，被广泛应用于植物组织培养中[21]。但不同植物对蔗糖浓度的要求不同[22-23]，为了提高培养效率必须对蔗糖适宜浓度进行筛选。另外，培养周期过长时，培养物因衰老，生物量和代谢物质的积累均下降，且会增加生产成本；周期过短时，因生物量不足会导致总生产量的下降，表明适宜培养周期的确定尤为重要。

综上所述，该试验以从纸荚豆种子获得的无菌苗为试材，利用无菌苗根诱导不定根后，探究了IBA浓度、蔗糖浓度以及培养周期对不定根生长的影响，为今后进一步完善纸荚豆不定根培养体系提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

纸荚豆种子由韩国忠北大学白基烨教授团队提供。

1.2 方法

1.2.1 不定根诱导

挑选生长饱满的纸荚豆种子，用自来水冲洗干净，利用75%乙醇消毒30 s和0.1%NaClO溶液消毒30 s，然后用无菌水冲洗4～5次，将已灭菌的种子接种至MS培养基(琼脂8 g/L，蔗糖30 g/L，pH值5.8)中，将接种完毕的种子置于25 ℃和光照16 h条件下培养[24]。待种子萌发成嫩芽后，将其接种至生根培养基(MS+3 mg/L IBA)中，当子叶展开，胚根上长出侧根时，切取侧根(长约1 cm)，将其平铺于生根培养基中暗培养。待长出不定根后，将其切分成单根，继续接种于生根培养基中继代增殖培养，当不定根生长30 d(根长约1 cm，呈白嫩状态)且达到一定量时用于后续试验。

1.2.2 试验设计

1) IBA浓度筛选 在培养皿(φ×h=9 cm×1.5 cm)中加高温灭菌的MS培养基(25 mL)[25]，将IBA培养浓度梯度分别设置为1、2、3、4和5 mg/L，培养基其它成分为蔗糖30 g/L和琼脂8 g/L，pH值调节为5.8，将增殖培养30 d不定根切成约1 cm后，将9个不定根外植体接入培养皿中，在25 ℃条件下暗培养，40 d后调查不定根生根数、根长、生长状态以及生物量。

2) 蔗糖浓度筛选 选取IBA最佳浓度(3 mg/L)作为培养条件，将蔗糖浓度梯度设置为20、30、40、50、60 g/L，培养基其他成分、操作方法以及调查指标如同1)。

3) 培养周期筛选 选取IBA最佳浓度(3 mg/L)和最佳蔗糖浓度(30 g/L)为培养条件，分别于10、20、30、40、50 d调查不定根根长、根数及生物量等相关指标，培养基其他成分和操作方法同1) 。

1.2.3 不定根根长、根数及生物量的测定

对纸荚豆不定根进行拍照后，利用Image J软件测根长和根数[26]。为了测定不定根生物量，将收获的不定根在流水下冲洗2～3次，利用M-3擦拭纸吸除表面水分后，称重，记录鲜物重(FW)。然后将不定根放在45 ℃恒温烘干箱中烘干48 h至恒重后，称重，得到干物重(DW)。

1.3 数据分析

培养皿试验每个处理设置10次重复，试验数据利用SPSS 22.0软件用邓肯氏新复极差法进行方差分析，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 IBA浓度对纸荚豆不定根生长的影响

用不同浓度IBA处理后对纸荚豆不定根生长状态进行调查的结果发现，经过一段时间的生长，接种的不定根变成红褐色，而新长出的侧根白嫩粗壮，随着IBA浓度的增加侧根数目显著增多，在IBA 3 mg/L处理不定根长势最好，当浓度增加至5 mg/L时纸荚豆不定根数目显著减少，根长变短(图1)。侧根长度和数目在IBA浓度为3 mg/L时达到顶峰，平均生长出约12个侧根，平均长度为11.563 mm，与其它4个处理组浓度相比，具有显著性差异(图2)。同时对培养40 d后的纸荚豆不定根的生物量进行测定的结果表明，在3 mg/L IBA处理下的纸荚豆不定根鲜重和干重分别达到了最大值1.162和0.076 g/vessel，优于其它4组处理的生物量(图3)。

图1 不同IBA浓度下增殖生长的纸荚豆不定根

图2 IBA浓度对纸荚豆不定根根长和根数的影响 图3 IBA浓度对纸荚豆不定根生物量的影响

2.2 蔗糖浓度对纸荚豆不定根生长的影响

经过不同蔗糖浓度处理40 d的纸荚豆不定根主根呈红褐色且变粗变长，新生部分仍为白色，并在分支点上不断长出侧根。在蔗糖浓度为30 g/L时长势最优，当浓度增加至50和60 g/L时，纸荚豆不定根长势不佳，不利于不定根生长(图4)。随着蔗糖浓度的增加侧根长和根数不断增加，浓度为30 g/L时，达到最大值，平均生长出约13个侧根，平均长度为11.565 mm，与其它4个处理组浓度相比，具有显著性差异(图5)。而在30 g/L蔗糖处理下的纸荚豆不定根的生物量虽优于其它处理组，但与60 g/L蔗糖处理组无显著性差异(图6)。

图4 不同蔗糖浓度下增殖生长的纸荚豆不定根

图5 蔗糖浓度对纸荚豆不定根根长和根数的影响 图6 蔗糖浓度对纸荚豆不定根生物量的影响

2.3 培养周期对纸荚豆不定根生长的影响

不同培养周期后对纸荚豆不定根生长状态进行调查的结果，培养10 d时可观察到主根变长，在生长点开始分化出侧根；20 d时主根颜色有变红的趋势，侧根长度不断增加，且在根尖处长出绒毛；在30 d时主根颜色逐渐加深，侧根根尖绒毛变多且出现变色现象；培养至40 d时可观察到侧根也开始分化成新的侧根；当培养至50 d时发现侧根数量显著增多；培养至60 d时，侧根根部均已变成红褐色，主根和侧根发生萎蔫，水分流失，已呈衰老状态(图7)。纸荚豆不定根的根长随培养时间增加总体呈现先上升的趋势；在20～40 d时，不定根根数呈平缓上升的状态，但培养至50 d后，侧根数量急剧增加，培养至60 d侧根数量无明显变化(图8)。且当培养周期为50 d时，不定根生物量最大，且显著高于前4组处理，但与60 d无显著性差异(图9)。

图7 不同培养周期下增殖生长的纸荚豆不定根

图8 培养周期对纸荚豆不定根根长和根数的影响

图9 培养周期对纸荚豆不定根生物量的影响

3 讨论与结论

不定根是一类代谢途径完善，具有与外植体相似的生产活性物质能力的器官，相较于细胞培养技术，不定根培养的代谢和活力更为稳定，是大规模生产目标产物的最佳培养方式[27-28]。例如，关倩[29]发现，利用不定根培养生产的北柴胡材料的产率、稳定性以及经济实用性远比愈伤组织培养和细胞培养高；李铁军[30]发现，植物不定根培养获得的西洋参不定根生物量要远高于细胞培养，同时具有比细胞培养更好的稳定性。因此，该文对纸荚豆不定根培养体系进行了探究，旨在缓解其资源短缺的问题。

不定根的生长发育依赖多种因素，植物生长调节剂的添加对其起关键作用[31]，而其中的IBA能诱导植物根细胞分化和分裂，从而促进不定根的形成。于晓坤等[32]人发现，当IBA浓度为1 mg/L时，贯叶连翘不定根的增殖效果最好；李润田等[33]人发现，2 mg/L的IBA对西洋参不定根诱导效果显著，可见IBA的添加量对不同植物生根效应也会有所差异。因而，该试验对IBA浓度进行筛选，发现IBA浓度过低纸荚豆不定根分化缓慢，浓度过高不定根生长明显受到抑制，当IBA浓度为3 mg/L时，纸荚豆不定根生长状态最佳。

碳源是植物组织培养成功与否的关键因素，而蔗糖是植物组织培养中最常见的碳源[34]，相较于其他糖类，具有稳定性高、污染率小、价格低廉等优点，并且能够持续维持植物细胞渗透压从而有效促进植物生长，但不同植物在培养过程中所需要的蔗糖浓度大小可直接影响其对养分吸收的量[35]。因此，对于完整的不定根培养体系来说，筛选出最适蔗糖浓度是必要的。如郭肖红等[36]发现，在蔗糖浓度为 60 g/L的条件下最利于丹参不定根生物量的积累；范艳敏等[37]人发现，当蔗糖浓度为30 g/L时，培养的木豆不定根鲜物重生物量高，生长状态好，不定根的分支变多且粗壮，蔗糖浓度过高会使不定根的渗透压升高，导致其生长状态较差，反而不利于不定根生长，这与该试验结果一致。

而不同的培养周期对植物的生长也至关重要。如Zhao等[38]人发现，培养三七不定根7周时，最有利于不定根的生长及生物量的积累。左北梅等[39]人探究了培养周期对人参不定根生长发育的影响，发现当培养周期为40 d时，收获的不定根生物量达到了最大值。可见，不同的培养周期对植物生长以及生物量的积累也有着较大的影响。该试验发现，培养周期过短纸荚豆不定根生长尚未完全，培养周期过长会导致不定根失水萎蔫，可能是培养基已无法提供不定根所需养分和水分而使其到达衰亡期的状态。试验结果说明，培养周期为50 d时，不定根达到最佳生长状态。

综上所述，该试验根据纸荚豆的生长状态、根长、根数以及生物量确定了纸荚豆不定根培养体系的最佳IBA浓度为3 mg/L，最佳蔗糖浓度为30 g/L，最佳培养周期为50 d，并且发现随着培养周期的增加，纸荚豆不定根主根和部分侧根根部颜色会有很大改变(白色变至红褐色)，且侧根尖部有白色绒毛的出现，此结果可为完善纸荚豆不定根培养体系提供理论参考。