茄子小孢子培养技术研究

范适　刘富中　陈钰辉　宋燕　刘志敏　张野　连勇

摘要：[目的]开展茄子小孢子培养技术研究，为茄子单倍体育种在生产实践上应用提供技术支持。[方法]以6个不同基因型茄子栽培品种为试材进行小孢子培养，探究基因型、花药预处理、花药壁组织及供体植株生长环境对茄子小孢子培养的影响。[结果]6个茄子栽培品种均能诱导出愈伤组织，但诱导频率差异明显，其中，37号和128号品种的小孢子愈伤组织诱导频率极显著高于其他品种（P<0.01，下同）；6个茄子品种中仅37号品种能形成再生植株，其中5株为单倍体植株，8株为双单倍体植株。茄子小孢子培养必需进行高温（36℃）热激处理，最佳处理时间6 d；低温（4℃）预处理不能启动茄子小孢子脱分化形成愈伤组织，但能极大促进愈伤组织形成；花药预处理以低温（4℃）处理6 d+高温（36℃）处理6 d的效果最佳，愈伤组织的诱导频率达60.0个/花药；花药壁组织与小孢子共培养能促进愈伤组织形成，最佳处理时间8-12 d。供体植株在露地环境条件下小孢子愈伤组织诱导频率极显著高于温室环境条件。[结论]对露地环境条件下种植的37号和128号茄子的花药进行低温（4℃）处理6 d+高温（36℃）处理6 d，可获得最佳的小孢子愈伤组织诱导效果。

关键词：茄子；小孢子培养；基因型；花药预处理；花药壁组织；供体植株生长环境

0引言

[研究意义]茄子（Solanum melongena L.）是重要的茄科蔬菜作物，但生产中易受青枯病和黄萎病等病虫危害，导致产量和品质降低。选育抗性品种是提高茄子产量和质量的有效方法（范适，2003），通过花药培养及小孢子培养快速获得双单倍体目标材料，能加速茄子育种进程（范适等，2014）。小孢子培养具有能排除花药壁组织干扰、诱导效率高等优点，在纯化亲本、突变体筛选及遗传研究等方面得到广泛应用。小孢子培养在烟草属（Kyo and Harada，1985）及芸苔属（顾祥昆等，2013；张振超等，2013）的一些品种上已取得较理想效果，但有关其他作物小孢子的培养却很难实现。因此，开展茄子小孢子培养技术研究，对促进茄子单倍体育种在生产实践上应用具有重要意義。[前人研究进展]北京市农业科学院蔬菜研究所单倍体组（1978）、刘独臣等（2008）通过茄子花药培养已成功获得单倍体植株。顾淑荣（1979）的研究结果证实，茄子的小孢子培养始于1979年，且获得了愈伤组织。Miyoshi（1996）采用游离小孢子培养方法成功获得了茄子再生植株。佟曦然等（2007）对茄子游离花粉培养发育过程进行较详细的形态细胞学观察，结果发现小孢子进行均等分裂和营养细胞分裂均能形成胚状体或愈伤组织。宋彦平等（2007）研究表明，单核靠边期小孢子是诱导愈伤组织发生的最佳时期，对花药进行低温和高温结合处理有利于小孢子存活，能促进小孢子脱分化，但愈伤组织诱导频率很低。李华等（2008）研究发现，对花药进行高温热激处理会导致小孢子体积膨大，活力提高。[本研究切入点]目前，国内外虽已开展茄子小孢子培养技术研究，但小孢子愈伤组织的诱导频率不高，难以从愈伤组织再分化获得完整植株。[拟解决的关键问题]分析影响基因型、花药预处理、花药壁组织及供体植株生长环境等对茄子小孢子愈伤组织诱导的影响，旨在完善茄子小孢子培养技术体系，为茄子单倍体育种在生产实践上应用提供技术支持。

1材料与方法

1.1试验材料

供试栽培茄子品种29号、30号、35号、36号、37号和128号均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所茄子课题组提供。2014年3月育苗，4月底定植于中国农业科学院蔬菜花卉研究所蔬菜基地露地大田。

1.2小孢子发育时期细胞学观察

参照李保庆（1995）的方法使用醋酸洋红染色剂常规制片法进行小孢子发育时期细胞学观察。用改良的卡诺固定液（95%7，醇：冰醋酸：氯仿=6：3：1）固定花蕾24 h，然后置于70%酒精中保存。观察时，将花药置于载玻片上，加少量醋酸洋红染色剂，从中部切开花药，使花粉散出，加盖玻片，在显微镜下观察并拍照。

1.3花药预处理方法

在前期试验基础上，选取37号和128号为试材，挑选盛花期处于单核中晚期的花蕾进行表面灭菌后剥出花药，接种于花药预处理培养基。低温（4℃）和高温（36℃）预处理均设0、2、4、6和8 d各5个时间；变温预处理设低温（4℃）处理2、4、6和8 d后再高温（36℃）处理2、4、6和8 d。

花药预处理培养基为MS+0.2 mg/L 2，4-D+0.5mg/L ZT+0.6%琼脂+2.0%蔗糖；培养条件为黑暗，白天温度为（274±1）℃、夜晚温度为（224±1）℃。

1.4小孢子培养方法

挑选黄绿色、膨大的花药，从中部切开，接种于诱导培养基中；每个培养皿（直径6 cm）加诱导培养基5 mL、接种8个中部切开的花药，石蜡膜封口，7 d后去掉药壁残渣。置于黑暗、温度为27℃环境中培养10 d后转入光照培养，光照时间为14 h/d，光强为2000 1X，培养5 d后，每培养皿加5 mL稀释培养基，直至愈伤组织形成。

诱导培养基为KM+0.2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/LZT+1.0 mg/L NAA+7.5%葡萄糖，稀释培养基为KM+0.1 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA+7.5%葡萄糖。

1.5花药壁组织与小孢子共培养

选取37号和128号为试材，设0、4、8和12 d等4个共培养处理时间，对比不同共培养时间下愈伤组织的形成情况，探讨花药壁组织与小孢子共培养对茄子小孢子培养的影响。

1.6供体植株生长环境

选取37号和128号为试材，分温室和露地2个生长环境进行常规栽培管理。温室：2014年1月播种，2月下旬定植；露地：2014年3月播种，4月定植。对比不同生长环境下供体植株诱导愈伤组织的状况，探讨供体植株生长环境对茄子小孢子培养的影响。

1.7植株再生及再生植株的倍性鉴定

将愈伤颗粒转移至含2.0%蔗糖、2.0 mg/L ZT、0.1 mg/L IAA和7.0 g/L琼脂的MS再生培养基上，获得不定芽，将不定芽移至含2.0%蔗糖、0.1 mg/L IAA和7.0 g/L琼脂的MS生根培养基上，待获得完整根系后进行驯化、移栽。再生植株用PAS全自动流式细胞仪进行染色体倍性鉴定。

1.8统计分析

各处理愈伤组织诱导频率以“个/花药”表示，采用SPSS 20.0进行统计分析，使用单因素方差分析进行组间差异显著性比较。

2结果与分析

2.1茄子小孢子培养过程的形态学观察

2.1.1小孢子发育时期的细胞学观察 为确定茄子花蕾长度与小孢子发育时期的对应关系，对不同长度花蕾进行醋酸洋红染色并进行细胞学观察，结果见图1。将不同长度花蕾分为9.2-9.9、10.0-11.1和11.2 mm以上三类（图1一A），分别对应茄子小孢子的四分体时期、单核中晚期和成熟期。

四分体时期（图1-B）小孢子母细胞经减数分裂成4个连在一起的细胞，呈四裂状、四面体状和四分状3种形式。单核中晚期（图1-C）小孢子的外部形态呈圆形，细胞核在细胞的中央或靠近边缘处。成熟期（图1-D）细胞体积变大，外部形态呈近圆形至椭圆形，极面观呈三裂圆形，有3条萌发孔，细胞表面可见颗粒状外壁纹饰。茄子小孢子培养最适宜的时期为单核中晚期，此时茄子花蕾长度为10.0-11.1 mm。

2.1.2愈伤组织形成过程的细胞学观察 用倒置显微镜观察小孢子培养过程中小孢子各发育时期的形态。花药经变温预处理后，小孢子出现明显膨大，直径可增大3倍（图2-A）；3 d后观察到小孢子的第一次分裂，多数为均等分裂（图2-B）；7 d后可观察到多细胞团（图2-C）；20 d后有愈伤组织出现（图2-D），愈伤组织呈黄绿色、圆球形，直径约1.0 iYlln。

2.2茄子基因型对愈伤组织形成的影响

由表1可知，6个茄子品种均能形成愈伤组织。其中，37号品种的愈伤组织诱导频率最高，达61.1个/花药，极显著高于其他品种（P<0.01，下同），且最早出现愈伤组织，第10 d即有愈伤组织形成；其次为128号品种，愈伤组织诱导频率为46.9个/花药，极显著高于除37号品种外的其他品种；愈伤组织诱导频率最低的为35号品种，仅7.1个/花药，极显著低于除36号品种外的其他品种，且最晚出现愈伤组织，第26 d才有愈伤组织形成。说明不同基因型的茄子小孢子愈伤组织诱导频率差异明显，以37号和128号品种小孢子愈伤组织发生能力较强。

2.3花药预处理对愈伤组织形成的影响

2.3.1低温（4℃）预处理对愈伤组织形成的影响对小孢子愈伤组织发生能力强的37号和128号品种进行低温（4℃）预处理，结果发现各处理组（2、4、6和8 d）的花药体积均未膨大，颜色未发生变化。将其中的小孢子接种到液体诱导培养基上后，通过倒置顯微镜镜检，发现仅1%-2%小孢子膨大，绝大多数小孢子未启动。培养40 d后，各处理均未形成愈伤组织。

2.3.2高温（36℃）预处理对愈伤组织形成的影响从图3可看出，高温（36℃）预处理使愈伤组织诱导频率极显著提高，以预处理6 d处理组的愈伤组织诱导频率最高，37号和128号品种的愈伤组织诱导频率分别为28.5和18.4个/花药，极显著高于同品种的其他处理。说明高温（36℃）预处理6 d茄子小孢子愈伤组织的发生能力最强。

观察发现，在小孢子培养过程中经高温（36℃）预处理各处理组的花药体积均出现膨大，至6 d时，花药体积增至最大，直径可达预处理前的2-3倍；花药颜色由淡绿色转为黄绿色。在培养过程中通过显微镜检查发现，高温（36℃）预处理2 d后小孢子膨大率约10%，至6 d时，小孢子膨大率达50%。说明小孢子启动导致花药体积膨大。

2.3.3变温预处理对愈伤组织形成的影响 由表2可知，小孢子接种到液体诱导培养基30 d后，各处理均有愈伤组织形成，愈伤组织的诱导频率为11.2-60.0个/花药，以低温（4℃）处理6 d+高温（36℃）处理6 d的诱导频率最高，为60.0个/花药，极显著高于其他处理；其次是低温（4℃）处理4 d+高温（36℃）处理6 d，诱导频率为44.4个/花药，与低温（4℃）处理8 d+高温（36℃）处理6 d的差异不显著（P>O.05，下同），显著（P<0.05）或极显著高于除低温（4℃）处理6 d+高温（36℃）处理6 d外的其他处理；低温（4℃）处理2 d+高温（36℃）处理2 d的诱导频率最低，仅11.2个/花药。因此，确定低温（4℃）处理6 d+高温（36℃）处理6 d是诱导茄子小孢子脱分化的最佳预处理组合。

2.4花药壁组织与小孢子共培养对愈伤组织形成的影响

从图4可看出，花药壁组织与小孢子共培养能提高小孢子愈伤组织的诱导频率，培养至第8 d时诱导频率达最高，37号和128号品种的愈伤组织诱导频率分别为52.4和40.0个/花药，极显著高于未进行花药壁组织共培养的处理组。当共培养时间延长至12 d时，愈伤组织诱导频率开始下降，但与共培养8 d处理组相比差异不显著。说明花药壁组织与小孢子共培养的最佳时间为8-12 d。

2.5供体植株生长环境对愈伤组织形成的影响

从图5可看出，在露地环境条件下小孢子愈伤组织诱导频率极显著高于温室环境条件，37号品种的愈伤组织诱导频率为53.7个/花药，比温室环境条件处理组高71.6%；128号品种的愈伤组织诱导频率为47.4个/花药，比温室环境条件处理组高65.7%。观察发现，在温室中生长的植株出现部分畸形果或无籽果实，说明供体植株在自然环境下生长更好。

2.6植株再生及再生植株的倍性鉴定

将愈伤组织转移至再生培养基上进行培养，约30 d出现绿色芽点，约65 d分化成不定芽（图6-A和图6-B）及丛生芽（图6-C和图6-D）；将2-3 cm高的不定芽从基部切除移至生根培养基，20 d后可形成不定根，35 d后可形成完整的根系（图6-E和图6-F）；移植后，90%以上的小植株能成活（图6-G）。

供试的6个茄子品种中，只有37号形成了13株再生植株，再生植株经流式细胞仪检测，5株为单倍体植株，8株为双单倍体植株。

3讨论

供试的6个品种茄子均能诱导出愈伤组织，但诱导频率差异明显，其中，37号和128号品种的小孢子愈伤组织诱导频率显著高于其他品种；37号品种可形成再生植株，29号和128号品种能分化不定芽，但出现玻璃化现象，最终未能成苗。表明茄子基因型差异对其小孢子培养影响较大。在烟草（Kyo and Harada，1985）、芥菜（顾祥昆等，2013）、甘蓝（张振超等，2013）等作物的研究中也出现相似的现象，说明基因型差异普遍存在于小孢子培养中。

小孢子培养一般需对花蕾或花药进行预处理，如营养饥饿（蔗糖饥饿和氮饥饿）、低温、高温（热激）、射线及激光处理等，其目的是通过预处理使小孢子偏离正常的配子体发育方向，启动小孢子脱分化，进而形成胚状体或形成愈伤组织通过器官化途径成苗。这些预处理中，以高温热激处理效果最佳。高温热激预处理能促进细胞对称分裂，改变小孢子发育方向（刘公社等，1995），是改变小孢子离体发育方向的主要途径（李华等，2008）。经热激等处理后的小孢子，在形态上改变了极性分布，细胞的生理状态也发生改变，从而引起小孢子分裂方式和发育方向发生改变，使小孢子偏离正常的配子体发育途径。Miyoshi（1996）、连勇等（2004）研究证实高温热激处理对茄子游离小孢子培养的必需性，高温热激处理会导致小孢子体积膨大，进而脱分化形成愈伤组织。本研究结果表明，对茄子花药进行高温（36℃）热激处理的最佳處理时间为6 d。仅对茄子花药进行低温（4℃）预处理，小孢子体积未膨大，无愈伤组织形成，原因可能是低温预处理不足以启动茄子小孢子的脱分化。但花药在低温（4℃）预处理一定时间后再进行高温（36℃）热激处理，能极大提高小孢子愈伤组织的诱导频率。

花药壁组织在启动小孢子脱分化及形成愈伤组织过程中发挥重要作用，甚至对不同物种离体花粉雄核发育也有较大促进作用（谢园园等，2014）。花药壁组织特别是某些由绒毡层起源的重要物质，在花粉脱分化过程中具有吸收、储存和转化等代谢库作用，同时有保护和调控作用，能促进小孢子脱分化的启动并进一步形成愈伤组织（董艳荣和龚义勤，2001）。本研究结果也表明，花药壁组织对启动小孢子脱分化及形成愈伤组织过程有较大促进作用。

供体植株生长环境会影响花粉的发育状况，进而影响植物小孢子培养（董艳荣和龚义勤，2001），生长在温室中的植株其小孢子诱导率低于在自然环境中生长的植株（Ercan et al.，2006）。本研究结果也支持以上观点，生长在温室环境条件下的茄子其小孢子愈伤组织诱导频率显著低于露地环境条件处理组，观察还发现出现较多畸形果及无籽或不成熟的茄子果实，证实温室中生长茄子植株的花粉发育质量低于自然环境中生长茄子植株的花粉。其原因：一是温室多使用玻璃、塑料薄膜等材料，对光有吸收和反射作用，特别是尘埃等杂质在温室顶部积累较多时，导致透光率降低，光质下降；二是温室昼夜温差较小，未达到植物生长发育所需的温周期；三是温室空气湿度大，作物易感病。

4结论

茄子的基因型差异对其小孢子培养影响较大，以37号和128号品种的小孢子愈伤组织诱导频率较高；对露地环境条件下种植的37号和128号茄子品种花药进行低温（4℃）处理6 d+高温（36℃）处理6 d，可获得最佳的小孢子愈伤组织诱导效果。