高效液相色谱法测定谷氨酸棒杆菌发酵液中17种氨基酸

王平 陈南柱 郑穗平

摘要[目的]建立一种简单高效、可同时检测发酵液中17种氨基酸的方法，并利用此方法对发酵液中的氨基酸进行定量分析。[方法]以2，4-二硝基氟苯为衍生试剂，使用Phenomenex Gemini NX C18（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，柱温30 ℃，流动相A为0.05 mmol/L乙酸钠溶液，流动相B为乙腈-水（1∶1，V/V），梯度洗脱，检测波长为360 nm。[结果]17种氨基酸在0.01～2.00 g/L线性相关良好，各相关系数在0.990以上，各氨基酸的加样回收率为87.4%～105.1%。采用该方法对发酵液中的氨基酸进行分析，有10种氨基酸积累，其中谷氨酸、瓜氨酸、精氨酸积累量较大。[结论] 该研究建立了一种简单高效、可同时检测发酵液中17种氨基酸的方法，为精氨酸进一步代谢改造提供理论依据。

关键词氨基酸；高效液相色谱；柱前衍生；发酵液

中图分类号S188+.4文献标识码A文章编号0517-6611（2017）09-0026-03

Determination of 17 Amino Acids in Corynebacterium glutamicum Fermentation Broth by High Performance Liquid Chromatography

WANG Ping， CHEN Nanzhu， ZHENG Suiping

（School of Bioscience and Bioengineering， South China University of Technology， Guangzhou， Guangdong 510006）

Abstract[Objective]A simple and efficient method for the simultaneous analysis of 17 free amino acids was established and applied to analyze free amino acids in Corynebacterium glutamicum. [Method] The method used precolumn derivatization with 2，4dintrofluorobenzene（DNFB）. The amino acids were separated in a Phenomenex Gemini NX C18 column （250.0 mm×4.6 mm，5 μm） at 30 ℃. The mobile phase was a mixture of phase A：0.05 mmol/L sodium acetate buffer （pH 6.8） and phase B∶1∶1（V/V） acetonitrile/water through the gradient elution. Detection was performed using a UV detector at 360 nm. [Result]The method showed good linearity with above correlation coefficients of 0990 when 17 kinds of amino acids concentrations were in the context of 0.01-2.00 g/L. The recoveries were between 87.4% and 1051%. Applying the method to analyze the fermentation broth ， it found that the broth had 10 kinds of amino acids accumulation and glutamic acid， citrulline and arginine among them accumulated a large amount. [Conclusion]The study establishes a simple and efficient method for the simultaneous analysis of 17 kinds of amino acids， provides theoretical basis for the metabolic transformation of the arginine.

Key wordsAmino acids；HPLC；Precolumn derivatization；Fermentation broth

作者簡介王平（1990—），男，湖北黄冈人，硕士研究生，研究方向：氨基酸发酵及代谢工程。

收稿日期2017-01-10

精基酸是构成蛋白质的氨基酸之一，是人体尿素循环的重要中间代谢产物，是合成神经组织中胍基丁酸的前体[1]，是机体内运输和储存氮的重要载体[2]，被广泛应用于食品、饲料、医药等行业。精氨酸主要通过微生物发酵生产[3]，生产菌株有枯草杆菌[4]、谷氨酸棒杆菌[5]、钝齿杆菌[6]等。谷氨酸棒杆菌发酵液中除目的氨基酸外，还有各种氨基酸和一些有机酸，分析各种氨基酸的产量将有利于明确代谢流向，为进一步积累代谢产物提供理论依据。

氨基酸的定量分析方法主要有气相色谱质谱法、液相色谱法、毛细血管法、氨基酸分析法等[7]。氨基酸分析仪是分析氨基酸的重要方法，但由于价格昂贵，使用受到限制。高效液相色谱结合柱前衍生的方法检测氨基酸具有简单、高效、成本低等特点，受到人们的关注。López-Cervantes等[8]采用芴甲基氯甲酸酯（FMOC-Cl）衍生氨基酸高效液相色譜法分析了虾废弃物蛋白水解物中16种氨基酸含量；于欢等[9]利用PITC柱前衍生高效液相色谱检测了柴胡泡制前后的17种氨基酸含量；赵英莲等[10]采用DNFB柱前衍生分析了树莓中14种游离氨基酸含量；高年发等[11]利用DNFB柱前衍生高效液相色谱法测定了葡萄酒中23种氨基酸含量。

笔者采用DNFB柱前衍生，优化液相条件，建立了谷氨酸棒杆菌发酵液中瓜氨酸、鸟氨酸等17种氨基酸的分析方法，提高谷氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸等精氨酸合成途径中中间产物的分离度，旨在为研究精氨酸合成途径的代谢改造提供理论依据。

1材料与方法

1.1仪器和试剂

Waters液相色谱仪（2695分离单元，2489紫外检测器）；色谱柱：Phenomenex Gemini NX C18（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；离心机；电子天平；pH计；恒温水浴锅。

19种氨基酸标品（Sigma）：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、瓜氨酸（Cit）、甘氨酸（Gly）、精氨酸（Arg）、苏氨酸（Thr）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Vla）、甲硫氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、组氨酸（His）、鸟氨酸（Orn）、赖氨酸（Lys）；氢氧化钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、冰醋酸、硼酸、硼砂为分析纯；乙腈、水为色谱纯。

1.2方法

1.2.1溶液配制。

pH 9.0 NaHCO3溶液：称取4.2 g NaHCO3加水定容至100 mL。

pH 7.0 磷酸缓冲溶液：称取3.4 g KH2PO4 转入500 mL容量瓶中，用约300 mL水溶解；取0.1 mol/L NaOH溶液7275 mL加入容量瓶中，混匀，再用水稀释至刻度。

氨基酸标品：称取氨基酸各200 mg，用pH 9.0的硼酸缓冲溶液溶解，定容至100 mL，作为母液，按比例混合即得到混标，4 ℃冰箱保存。

衍生试剂：取1 mL DNFB置于100 mL棕色容量瓶中，加乙腈定容，置于4 ℃冰箱避光保存。

流动相A：0.05 mol/L乙酸鈉缓冲溶液，含1%的N，N-二甲基甲酰胺，pH 6.8。称取4.1 g无水乙酸钠，溶于约950 mL水中，用冰乙酸调节pH至6.8。加入10 mL N，N-二甲基甲酰胺，再定容至1 000 mL。用0.22 μm水相微孔滤膜过滤，并超声脱气10～20 min。

流动相B：乙腈水溶液（1∶1，V/V）。

1.2.2发酵液制备。

将谷氨酸棒杆菌ATCC 14067-pET-XK99E-argBH268E（过表达argB）在3 L发酵罐上进行补料发酵，发酵过程中定时取样，1 200 r/min 离心5 min，取上清4 ℃保存。

1.2.3衍生反应。

取150 μL氨基酸标品加入到2 mL 离心管中，再加入150 μL pH 9.0 NaHCO3混匀，加入150 μL DNFB溶液，放入60 ℃水浴锅中，暗处反应60 min。取出冷却至室温，加入1 050 μL 平衡缓冲溶液（pH 7.0 磷酸溶液），静置10 min，12 000 r/min离心5 min，用0.22 μm有机相微孔滤膜过滤，取过滤液1 000 μL。

1.2.4色谱条件。

色谱柱：Gemini NX C18（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A：0.05 mol/L乙酸钠缓冲溶液（pH 68）；流动相B：乙腈水溶液；流量：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：360 nm。洗脱程序见表1。

2结果与分析

2.1液相条件优化

对Agilent SB C18 （150.0 mm×4.6 mm，5 μm）、Hypersil BDS C18（250.0 mm×4.6 mm， 5 μm）和Gemini NX C18（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱进行分析，结果发现，Agilent SB C18柱（150.0 mm×4.6 mm，5 μm）的分离效果较差，Cit、Gly、Arg、Thr、Pro、Ala较集中，难以分开。而Hypersil BDS C18（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）比Agilent SB C18（150.0 mm×4.6 mm，5 μm）柱长，分离效果明显较好，但Arg、Thr难以分开。而Gemini NX C18（150.0 mm×4.6 mm，

5 μm）对17种氨基酸的分离效果较好，但有些峰太近，需进一步优化。

对其洗脱程序进行优化，将有重叠的峰尽可能分开，首先将流动相B的比例设为15%，0～22 min，流动相B逐步变为30%，减小溶剂峰DNP-OH对Asn和Gln的干扰，有利于Cit与Gly、Arg的分离；22～30 min，流动相B变为40%，将Pro和Ala分开；30～34 min，流动相B快速变为60%，缩短分析时间；34～38 min，流动相B变为70%，促进Val和Met的分离；38～50 min，流动相B变为80%，有利于Leu、Ile和Trp、Orn、Lys和NH+4的分离。为了冲掉残留在柱中的杂质以及使柱子恢复到初始状态，有利于下一个样品的稳定性，对温度、pH等进行优化确定最佳色谱条件。优化后的结果见图1。由图1可知，除Gln受到溶剂峰DNP-OH的干扰，Phe和His重合外，其他16种氨基酸的分离效果较好。

2.2线性关系

将氨基酸母液用硼酸缓冲液稀释，得到不同质量浓度的氨基酸标准液，按“1.2.3”方法衍生反应，静置离心，过滤后，进行液相分析，得到17种氨基酸的线性关系范围，其相关系数均大于0.990，说明在设定范围内线性关系良好（表2）。

2.3精密度

取氨基酸混标，按“1.2.3”方法衍生分析，进样6次检测，计算各氨基酸峰面积的相对标准偏差，结果显示，Asp的RSD为1.29%，Glu的RSD为1.33%，Asn的RSD为1.32%，Gln的RSD为1.79%，Cit的RSD为1.42%，Gly的RSD为1.22%，Arg的RSD为1.27%，Thr的RSD为132%，Pro的RSD为1.35%，Ala的RSD为1.35%，Val的RSD为1.38%，Met的RSD为1.30%，Ile的RSD为1.51%，Leu的RSD为1.29%，Trp的RSD为1.35%，Orn的RSD为1.20%，Lys的RSD为1.34%。说明该仪器的精密度良好，满足分析要求。

2.4重复性

将发酵液分成6份按“1.2.3”方法衍生分析，计算各氨基酸峰面积的RSD值。结果显示，Asp的RSD为1.20%，Glu的RSD为1.30%，Gln的RSD为2.79%，Cit的RSD为0.90%，Gly的RSD为1.49%，Arg的RSD为193%，Thr的RSD为3.77%，Pro的RSD为1.60%，Ala的RSD为2.03%，Orn的RSD为1.89%，Lys的RSD为2.20%。 说明用该方法处理样品，重复性良好。

2.5稳定性

取发酵液按“1.2.3”方法衍生分析，并在0、2、4、8、12、16、24 h进样，计算各峰的RSD，结果显示Asp的RSD为3.48%，Glu的RSD为0.89%，Gln的RSD为2.87%，Cit的RSD为0.86%，Gly的RSD为1.09%，Arg的RSD为095%，Pro的RSD为0.85%，Ala的RSD为0.80%，Orn的RSD为0.69%，Lys的RSD为0.90%。说明在24 h内，样品稳定性较好。

2.6回收率

取已知含量的发酵液6份，分别加入一定浓度的氨基酸标样混合溶液，按“1.2.3”方法衍生分析，计算各氨基酸的回收率，结果显示，Asp的RSD为99.4%，Glu的RSD为934%，Gln的RSD为90.2%，Cit的RSD为87.4%，Gly的RSD为96.0%，Arg的RSD为88.1%，Pro的RSD为97.1%，Ala的RSD为105.1%，Orn的RSD为94.7%，Lys的RSD为96.3%，回收率在87.4%～105.1%，满足分析要求。

2.7样品含量

分別对42、48、54 h的发酵液离心取上清，并稀释一定倍数，按“1.2.3”方法衍生分析，样品峰图见图2。对结果进行外标法定量，结果见表3。由表3可知，发酵液中氨基酸主要有Asp、Glu、Gln、Cit、Gly、Arg、Pro、Ala、Orn、Lys 10种。不同氨基酸的积累量差异较明显，其中Glu、Cit、Arg积累量较多，Gly、Ala、Orn、Lys次之，Asp、Gln、Pro很少。其中精氨酸合成途径的中间物质瓜氨酸积累量较大，没有快速转化为精氨酸，即精氨酸合成途径中瓜氨酸到精氨酸的转化效率需加强。

3结论

该方法很好地将17种氨基酸进行了分离，可同时分析17种氨基酸，且分析范围广，达0.01～2.00 g/L，样品处理简单，为发酵液的分析提供了简单有效的方法。同时，将此方法用于分析谷氨酸棒杆菌发酵液，发现Glu、Cit、Arg等大量积累，为精氨酸进一步代谢改造提供理论依据。

参考文献

[1] 张伟国，钱和.氨基酸生产技术及其应用[M].北京：中国轻工业出版社，1998：89-90.

[2] 郭长江，徐琪寿.精氨酸体外对免疫细胞功能的调节作用[J].氨基酸杂志，1991（1）：4-5.

[3] NAKAYAMA T，SODA K.Production of amino acids [J].Nutr Req Commerc Import Microorg，1998，7（4）：202-235.

[4] KISUMI M，KATO J，SUGIURA M，et al.Production of Larginine by arginine hydroxamateresistant mutantsof Bacillus subtilis[J].Appl Envir Microbiol，1971，22（6）：987-991.

[5] PARK S H，KIM H U，KIM T Y，et al.Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for Larginine production[J].Nature communications，2014，5：4618.

[6] MAN Z W，XU M J，RAO Z M，et al.Systems pathway engineering of Corynebacterium crenatum for improved Larginine production[J].Scientific reports，2016，6：28629.

[7] 江海风，马品一，金月，等.氨基酸分析方法的研究进展[J].现代科学仪器，2013（4）：55-61.

[8] LPEZCERVANTES J，SNCHEZMACHADO D I，ROSASRODRGUEZ J A.Analysis of free amino acids infermented shrimp waste by highperformance liquid chromatography[J].Journal of chromatography A，2006，1105（1/2）：106-110.

[9] 于欢，钟凌云，阳强，等.PITC柱前衍生HPLC测定柴胡炮制前后17种氨基酸含量[J].中国实验方剂学杂志，2015（14）：25-27.

[10] 赵英莲，牟德华，李艳.2，4-二硝基氟苯柱前衍生 HPLC 检测树莓中游离氨基酸[J].食品科学，2015，36（6）：178-182.

[11] 高年发，李磊，邓旭衡，等.反相高效液相色谱法测定葡萄酒中23种氨基酸的研究[J].中国酿造，2011，30（2）：155-157.