大竹蛏源多肽与钙螯合物的制备工艺及生物活性研究

王梦娅++陈媛媛++钱文举++胡沁莹++周宇++王梦璠++韩曜平

摘要：以大竹蛏肉蛋白和氯化钙为原料，复合酶解法制备大竹蛏源多肽螯合钙，考察螯合温度、时间、大竹蛏源多肽与钙离子的质量比和pH对螯合率和螯合物中钙含量的影响。根据响应面分析试验结果，在温度50 ℃，时间40 min，质量比1∶2，pH7.0条件下，螯合率为32.73%，螯合物中钙含量为41.89%。傅里叶变换红外光谱扫描检测结果表明，竹蛏源多肽与钙离子形成了螯合物，以硫代巴比妥酸法和抑菌圈试验分别验证此螯合物具有抗氧化活性和抑菌活性。

关键词：大竹蛏；多肽钙螯合物；制备工艺；抗氧化活性；抑菌活性

中图分类号：S986.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）08-1530-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.031

The Bioactivity and Preparation Technology for Peptides-Ca2+ from Solen grandis Proteins

WANG Meng-ya，CHEN Yuan-yuan，QIAN Wen-ju，HU Qin-ying，ZHOU Yu，WANG Meng-fan，HAN Yao-ping

（ College of Biology and Food Science， Changshu Institute Technology， Changshu 215500， Jiangsu，China）

Abstract： The combination between Solen grandis polypeptides and calcium chloride was studied based on the preparation of Solen grandis polypeptides from compound enzyme. Under given conditions，calcium binding capacity and chelated calcium content were investigated as a function of reaction temperature，time，mass ratio between Solen grandis polypeptides and calcium chloride（P/C） and pH. On the basis of the results of response surface analysis，the four reaction parameters were optimized to be 50 ℃，40 min，a P/C ratio of 1∶2 and pH 7.0，yielding a calcium binding capacity of 32.73% and a chelated calcium content of 41.89%. The formation of ca-polypeptide chelate was confirmed by the FT-IR spectra. The result indicates that the calcium chelate with Solen grsndis polypeptides. TBA test and the experiments of anti-bacterium-circles show that the chelate products are characteristic of oxidation resistance and antibacterial activity.

Key words：Solen grandis；peptides-Ca2+；preparation technology；antioxidant activity；antibacterial activity

钙离子是机体内各项生命活动都不可缺少的一种物质。它对于维持生物细胞膜两侧的生物电位，维持正常的神经传导功能，维持正常的肌肉伸缩及舒张功能以及神经肌肉传导功能具有非常重要的作用，而且一些激素的作用机制也均需钙离子表现出来，如作为凝血因子参与凝血过程；参与肌肉包括骨骼肌和平滑肌的收缩过程；参與神经递质的合成与释放，激素的合成与分泌过程；骨骼的形成等[1-3]。由于中国的膳食结构以植食性为主，难以摄入足够的易被人体吸收的钙，而含钙量较多的奶和奶制品的摄入量较少，致使中国人普遍缺钙，是全球居民缺钙的首要国家[4]。而钙离子与多肽螯合形成有机肽后，能够借助多肽在体内的吸收机制提高其吸收率[5]。金属钙离子与蛏子多肽形成的螯合物具有口感好、易吸收等特点，并且其他方面的生物活性如抗氧化性和抗菌活性也得到了增强，同时提高了钙离子和蛏子的营养价值。蛏子肉口味鲜美，营养丰富，俗称“海里的人参”，“小人仙”，一直是餐桌上的常客，而且蛏子养殖具有生长快、生长周期短、易管理、产量高、成本低、效益好、见效快等特点，总之价格便宜，是一种大众化的海产食品，可以作为很好的多肽来源[6]。

本研究以江苏常熟常见的大竹蛏为原料，采用酶法[7]水解制备得到蛏子肉蛋白水解物，将此水解物与钙离子螯合在不同的条件下进行螯合并研究其螯合物的抑菌活性和抗氧化活性，以期获得最佳的螯合工艺和具有高抑菌活性和高抗氧化活性的金属离子多肽螯合物，为具有抑菌活性和抗氧化活性的金属离子多肽螯合物的研究与开发以及为补钙的保健品研究与开发提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

竹蛏，江苏常熟农贸市场；大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，常熟理工学院生物与食品工程学院微生物实验室；木瓜蛋白酶、风味蛋白酶，上海奥宇生物科技有限公司；亚油酸标品、α-生育酚标品、2-硫代巴比妥酸标品，Sigma公司；诺氟沙星药品，上海浩然生物技术有限公司。AKTA蛋白纯化系统：醋酸，无水乙醇，氯化钙，乙二胺四乙酸二钠，铬黑T，氨水-氯化铵缓冲液。LB固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL。牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3 g，氯化钠5 g，蛋白胨10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.4～7.6。

台式高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；雷磁牌台式pH计（pHSJ-4A），上海仪电科学仪器股份有限公司；恒温培养摇床，上海申贤恒温设备厂；傅里叶变换红外光谱仪（NICOLET380型），美国Thermo公司；超净工作台，苏州佳宝净化工程设备有限公司；紫外分光光度计；冷冻干燥机；绞肉机；恒温加热磁力搅拌器。

1.2 试验设计

1.2.1 蛏子多肽的制备 将蛏子去壳、去杂物，洗净蛏子的肉蛋白，绞肉机搅碎，加0.5倍的水，调pH至6.0左右，以质量比100∶1分别加入木瓜蛋白酶和风味蛋白酶，在50 ℃下，放入恒温加热磁力搅拌器中酶解5 h，酶解后，放入离心管中5 000 r/min离心10 min，去沉淀取上清，漏斗过滤，将滤液倒入适量大小的培养皿中（厚度1 cm左右），保鲜膜封住，放入冰箱冷冻成块，膜上戳小孔，放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥24 h，得到冻干粉。

1.2.2 蛏子多肽与钙螯合物的制备 按一定的质量比称取蛏子多肽冻干粉和氯化钙，加入适量的蒸馏水，调节pH、温度，在恒温振荡培养箱中进行一定时间的螯合反应，螯合结束后，向螯合溶液中加入无水乙醇进行离心，去上清取沉淀，将沉淀放入真空冷冻干燥机中干燥12 h，得到冻干粉。

1.2.3 单因素试验 ①螯合温度对螯合率和螯合物中钙含量的影响。称取5份200 mg的蛏子多肽粉末，分别加入277.5 mg的氯化钙，用20 mL的蒸馏水溶解，调节pH至6.5，分别在30、40、50、60、70 ℃下放入恒温振荡培养箱中进行螯合反应40 min。②螯合时间对螯合率和螯合物中钙含量的影响。称取4份200 mg的蛏子多肽粉末，分别加入277.5 mg的氯化钙，用20 mL的蒸馏水溶解，调节pH至6.5，放入50 ℃恒温振荡培养箱中分别进行螯合反应30、40、50、60 min。③螯合pH对螯合率和螯合物中钙含量的影响。称取9份200 mg的蛏子多肽粉末，分别加入277.5 mg的氯化鈣，用20 mL的蒸馏水溶解，分别调节pH为4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，放入50 ℃恒温振荡培养箱中进行螯合反应40 min。④多肽与钙离子的质量比对螯合率和螯合物中钙含量的影响。称取7份200 mg的蛏子多肽粉末，分别加入50、40、66、67、100、200、400、800 mg的氯化钙，即分别以质量比4∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4，用20 mL蒸馏水溶解，调节pH至6.5，温度50 ℃，放入恒温振荡培养箱中进行螯合反应40 min。

1.2.4 螯合物中钙含量和螯合率的测定 按照“1.2.2”中的螯合反应步骤，螯合结束后，取5 mL螯合溶液加入80%乙醇溶液45 mL离心去沉淀取上清，取10 mL上清液放入锥形瓶中，氨水-氯化铵缓冲液调pH至12左右，加铬黑T溶液，用EDTA二钠溶液滴定，记录每个锥形瓶所耗EDTA二钠溶液体积数，取平均值，按照下列公式进行计算：

游离钙离子质量=CEDTA×滴定体积×40×螯合溶液稀释倍数；

螯合物中钙含量=

■×100%

螯合率=■×100%

1.2.5 响应面分析确定最佳螯合工艺 利用Box-Behnken设计方法，4因素3水平，共29组设计配方进行螯合及滴定试验，之后进行响应面分析，确定最佳螯合工艺（表1）。

1.2.6 检测竹蛏多肽螯合钙离子后的变化 将蛏子多肽钙螯合物通过凝胶柱，分离纯化后的螯合物冷冻干燥使成冻干粉，然后进行傅里叶变换红外光谱检测，与多肽进行比较氨基（3 400 cm-1）和羧基 （1 700 cm-1）的变化。

1.2.7 分离纯化多肽螯合物 利用AKTA蛋白纯化系统，将竹蛏多肽钙螯合物进行分离纯化，之后收集目标峰值对应的溶液即纯化后的螯合物溶液冷冻干燥，得到冻干粉，备用。

1.2.8 抗氧化活性检测 采用硫代巴比妥酸法[8]测定螯合物的抗氧化活性，α-生育酚作为标准品比较螯合物的抗氧化活性。

1.2.9 抑菌活性检测 选用大肠杆菌（革兰氏阴性）和枯草杆菌（革兰氏阳性）两种菌做滤纸片[9]抑菌圈试验，比较抑菌圈的有无和大小，检测螯合物的抑菌活性。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

1）螯合温度对螯合率和螯合物中钙含量的影响。由图1可知，螯合温度对螯合物中的钙含量影响不大，而螯合温度50 ℃时有较好的螯合率，所以选取50 ℃为最佳的螯合温度。

2）螯合时间对螯合率和螯合物中钙含量的影响。由图2可知，螯合时间对螯合物中钙含量的影响不大，在螯合40 min后有较好的螯合率，所以选取40 min为最佳的螯合时间。

3）螯合pH对螯合率和螯合物中钙含量的影响。由图3可知，pH在3.0～7.5时螯合物中钙含量变化很小，pH在7.5～9.0时螯合物中钙含量一直在升高；而pH在3.0～7.5时螯合率变化较明显，尤其pH为7时螯合率最高，而pH为7.5时螯合率略微下降，之后便一直上升。当pH为7.5之后螯合物中钙含量和螯合率一直都呈较大的上升趋势，根据试验过程，推测原因是在螯合前加入的氢氧化钠与钙离子结合，溶液中的游离钙离子量减少，导致螯合率和螯合物中钙含量同时迅速升高。所以选择pH为7。

4）多肽与钙离子的质量比对螯合率和螯合物中钙含量的影响。由图4可知，质量比对螯合率的影响不大；在质量比1∶1之前，随着质量比的变大，螯合物中钙含量的变化不大，在1∶1处有一个较大的提高，在1∶1之后，螯合物中钙含量提升较快。作为最佳的制备工艺，考虑到材料的利用率，在质量比0.5和0.25时，虽然螯合物钙含量相对较高，但根据试验情况，试验中氯化钙的浪费情况较严重，利用率不高，而且还需要对螯合产品中多余氯化钙进行分离处理，所以选取1∶2作为最佳的质量比。

2.2 响应面分析法优化试验结果

根据以上单因素试验结果确定对多肽与钙螯合反应影响较明显的4个因素的较好水平，由于螯合物中钙含量变化随着反应条件的改变不如螯合率变化明显，故以螯合率作为判定最佳反应条件的响应值进行响应面优化试验[10]（表2）。

利用Design expert 9.0.6软件对表1数据进行分析，得到以螯合率为响应值的线性拟合方程：螯合率=-644.898 75-15.254 44A+1.832 92B+2.344 5C+169.296 67D+0.033 333AB+0.053 333AC+1.02AD-0.008 75BC-0.06BD-0.195CD-1.444 44A2-0.010 88B2 -0.000 721 25C2-11.4D2。式中，A为质量比；B为时间；C为温度；D为pH。且通过计算得蛏子多肽与钙螯合反应的最佳条件是质量比1∶2，温度49.98 ℃，时间39.74 min，pH 6.98，预测螯合率32.73%。按照此条件，重复3次取平均值，实际螯合率为32.33%，说明预测值与实际结果拟合性良好，响应面的优化方案可以使用，较为可靠。表3为模型显著性分析，由表3可知A、D及AB较显著。

2.3 多肽螯合钙离子后的变化结果

由图5可知，螯合物和蛏子多肽的特征峰位置相同，而每个特征峰对应的基团含量相差较大。在 3 400 cm-1附近多肽和螯合物都出现了强而宽的吸收峰，应该是-COOH中的-OH与N-H的伸缩带重叠，是因为多肽中含有大量的-COOH和-NH2，螯合物中-OH带较多肽向低波段移动了一些，一级螯合物中-OH吸收峰面积远小于多肽中的峰面积，由于多肽在变成螯合物后，溶解度大大降低，表明多肽中的-OH参与螯合环的构成，-NH2也可能以提供孤电子对的方式参与螯合环的形成；在1 636 cm-1附近的吸收峰来自-C=O的伸缩振动，螯合物中-C=O帶较多肽向低波段稍稍移动了一些，螯合物和多肽的吸收峰面积比较后也减少了，说明-C=O也参与了螯合环的构成；1 402 cm-1附近的吸收峰来自酰胺键中的-C-N，同样也可能参与了螯合环的形成。综上所述，蛏子多肽和钙离子已形成螯合物。

2.4 螯合物的分离纯化

由图6可知，为蛏子多肽与钙螯合物经过AKTA蛋白分离纯化系统后的曲线。活性检测表明，多肽螯合物主要集中在最高峰值处。

2.5 抗氧化性检测结果

通过硫代巴比妥酸法检测亚油酸氧化量，检测红色素在535 nm处的吸光度，同α-生育酚的抗氧化性对照比较，根据公式抑制率=（M-N）/（M-W）×100%，（M表示加入50 μL纯化水+0.2 mL亚油酸混合液的吸光度，N表示加入50 mg多肽+0.2 mL亚油酸混合液的吸光度，W表示加入50 μL α-生育酚+0.2 mL亚油酸混合液的吸光度），计算试验所得数据，可得出蛏子多肽钙螯合物的抗氧化活性相当于α-生育酚的71.08%。

2.6 抑菌活性检测结果

通过滤纸片抑菌圈试验，得到蛏子多肽螯合物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有一定的抑菌效果。

3 结论

考虑到工艺简化，提高资源利用率，根据响应面分析结果得到最佳的螯合工艺为蛏子多肽与钙离子的质量比为1∶2，温度49.98 ℃，时间39.74 min，pH 6.98。根据实际情况，确定最佳的大竹蛏多肽与钙离子的最佳螯合条件为蛏子多肽与钙离子的质量比为1∶2，温度50 ℃，时间40 min，pH 7.0。

螯合后的产物经过分离纯化，傅里叶变换红外光谱检测说明大竹蛏多肽和钙离子进行了螯合反应，硫代巴比妥酸法试验表明其具有较好的抗氧化性，抑菌圈试验表明此螯合物也具有抗菌活性，所以有望作为一种良好的保健品。

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