不同浓度重铬酸钾溶液胁迫对洋葱根尖生理生化特性的影响

李秋江++赵云霞++谢雅舒++王星皓++马亚洪++李嘉文++宋桂芹

摘要：研究不同浓度重铬酸钾溶液及不同处理时间对洋葱（Allium cepa L.）根尖细胞有丝分裂和植物保护酶系统的影响，旨在为探究重金属铬作用于植物体的生理生化机理提供参考。分别用0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 mg/L重铬酸钾溶液处理洋葱根尖6、12、18、24 h，而后收集洋葱根尖组织，分别用于洋葱根尖组织石蜡切片、苏木素染色观察和测定根尖细胞中的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽-S转移酶活性及丙二醛含量。结果表明，不同浓度重铬酸钾溶液处理洋葱根尖不同时间后，细胞有丝分裂出现异常分裂，并伴有微核的产生；无论处理时间长短，随着处理浓度的增加，细胞中的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽-S转移酶活性都呈现先上升、后下降的变化趋势，而丙二醛含量先缓慢下降、后迅速上升；当处理浓度一定时，随着处理时间的延长，细胞中的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽-S转移酶活性呈上升趋势，而丙二醛含量呈缓慢下降趋势。说明重铬酸钾溶液对洋葱具有一定的细胞毒性作用，可能与调控细胞中各种酶系统的活性及含量有关。

关键词：洋葱（Allium cepa L.）；重铬酸钾；超氧化物歧化酶（SOD）；过氧化氢酶（CAT）；谷胱甘肽-S转移酶（GST）；丙二醛（MDA）

中图分类号：S633.2+78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）08-1489-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.022

Effects of Different Concentration of K2Cr2O7 Solution Stress on the Physiology and Biochemistry of the Tip Cell of Allium cepa

LI Qiu-jiang，ZHAO Yun-xia，XIE Ya-shu，WANG Xing-hao，MA Ya-hong，LI Jia-wen，SONG Gui-qin

（The Department of Biology of North Sichuan Medical College， Nanchong 637000， Sichuan， China）

Abstract： To provide references for exploring the physiological and biochemical mechanisms of chromium ions on plants， the effects of potassium dichromate（K2Cr2O7） with different treatment time on the mitosis and plant protection enzyme system of root tip cells of Allium cepa L. were studied. K2Cr2O7 solutions with different concentration were used separately to treat the root tip of A. cepa for 6， 12， 18， 24 h. The A. cepa root tip tissue were collected for tissue paraffin sections， hematoxylin and testing the activity of SOD， CAT， GST and the content of MDA. After the tip cell being prosessed by K2Cr2O7 solution with different concentration for different time， abnormal mitotic cell division and micronucleus were found in mitotic cells. No matter the length of processing time， with the increase of K2Cr2O7 concentration， the activity of SOD， CAT， GST in cell increased at first and then decreased； but the content of MDA decreased slowly at first and then increased rapidly. When the K2Cr2O7 solution concentration was constant， with the extension of treatment time， the activity of SOD， CAT， GST in cell showed an increasing trend； while the content of MDA decreased slowly. Potassium dichromate solution had certain toxic effects on A. cepa cell， which may be related to regulating the activity and the content of various enzyme systems in cell.

Key words： Allium cepa L.； potassium dichromate solution； SOD； CAT； GST； MDA

隨着人类社会经济的发展，环境污染尤其是农田生态环境污染成为社会最关心的问题。造成农田生态环境污染的重金属有镉（Cd）、铅（Pb）[1]、汞（Hg）、砷（As）、铬（Cr）、铜（Cu）、锰（Mn）[2，3]及锌（Zn）等，而铬是其中最重要的污染源。铬作为最主要的重金属污染物，对动植物均有一定的毒害作用，其中对植物毒害最大的主要是六价铬，其绝大部分可被植物根部吸收，造成植物的畸形与突变[4]。植物在正常的生长代谢过程中，耗氧是必不可少的，同时体内会产生大量的自由基、过氧化物、活性氧等有害物质。这些有害物质对细胞膜有一定的破坏作用，并且大量长期存在于植物体内会影响植物的正常生长代谢，对植物产生严重的毒害作用[5]。但是植物本身对这些有害物质有一定的清除能力，因此正常情况下，自由基的产生与消除处在一种动态平衡的状态[6，7]。然而重金属可在土壤中长期存留，不易降解；长时间的重金属蓄积将打破植物的动态平衡状态，加速体内自由基的积聚，延缓自由基的清除，长此以往将造成植物出现一种不可逆的损伤，最终导致植物死亡。超氧化物歧化酶（SOD）[8]、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽-S转移酶（GST）[9]属于植物体内的保护酶系统，可清除自由基，从而对机体起着保护作用。微量丙二醛（MDA）能延缓自由基的清除，起着破坏作用。近年来重金属对植物机体的毒害作用报道不少，但是通过检测重金属胁迫后植物机体中各种酶系统活性而更直接反映其毒害程度的报道较少。因此，试验开展了这方面的探讨，以期深入阐述重金属对植物毒害的机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及处理 植物材料选择洋葱（Allium cepa L.），在2015年夏季购于南充市当地的市场，参试样品大小均匀，生长状况良好，未使用任何药物处理。将洋葱随机分为试验组和对照组，试验组分别用12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 mg/L重铬酸钾（K2Cr2O7，四川科伦药业股份有限公司生产）溶液处理，对照组全程用去离子水处理。

1.1.2 洋葱的培养 将买来的洋葱取根尖，洗净后剥去老皮，去离子水清洗处理，待根尖长至2～3 cm后，换用不同浓度的重铬酸钾溶液分别处理6、12、18、24 h，然后剪下根尖组织，分别用于石蜡切片制作和酶活性的测定。

1.1.3 仪器与试剂 仪器主要有正立荧光显微镜、石蜡包埋机与轮转切片机（德国徕卡仪器有限公司）；还有酶标仪（美国BIO-RAD公司）、721分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；试剂主要有乙醇、甲醛、醋酸、苏木素等，SOD、CAT、GST、MDA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，货号分别为A001-3、A007-1、A004、A003-2。

1.2 方法

1.2.1 洋葱根尖石蜡切片 分别选取不同浓度、不同时间处理后的洋葱根尖组织3根置于FAA固定液（配置比例为38%甲醛5 mL+冰醋酸5 mL+70%乙醇90 mL）中固定2～3 d，经过脱水、浸蜡、透明等步骤包埋切片。采用苏木素染色，显微镜下观察细胞有丝分裂情况。

1.2.2 SOD、CAT、GSH活性及MDA含量测定 分别选取不同浓度、不同时间处理后的长度为2～3 cm洋葱根尖10根，测其总重量，碾碎。根据试剂盒说明书的步骤，以10根根尖的总酶活性作为统计指标结果。用分光光度计检测CAT、GSH活性及MDA含量，用酶标仪检测SOD活性。

1.3 数据处理

试验所得数据采用Microsoft Office Excel 2010程序处理，并用其制表和绘图；运用SPSS 11.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 重铬酸钾溶液及处理时间对洋葱根尖细胞有丝分裂染色体的影响

不同浓度重铬酸钾溶液及不同处理时间对洋葱根尖细胞有丝分裂染色体的影响情况见图1。从图1可见，重铬酸钾溶液处理后，洋葱根尖细胞形态不一，细胞核也不规则；有的细胞在分裂过程中出现了不对称分裂、染色体桥、染色体滞后、不同步分裂等现象，各处理均形成了微核，有微核效应，还有的细胞在分裂过程中纺锤丝被打断，也可能出现微核，但是微核率各不相同。而对照组无微核现象产生。

2.2 重铬酸钾溶液及处理时间对洋葱根尖细胞SOD活性的影响

不同浓度重铬酸钾溶液处理对洋葱根尖细胞SOD活性的影响情况见图2，不同处理时间对洋葱根尖细胞SOD活性的影响情况见图3。从图2、图3可见，无论处理时间的长短，洋葱根尖细胞中SOD活性随着重铬酸钾溶液浓度的增加都呈现先上升、后下降的变化趋势，均在25.0 mg/L处理达到峰值。且处理6、12、18、24 h后的SOD活性在25.0 mg/L处理明显上升，而在低浓度胁迫下，随着处理时间的延长，洋葱根尖细胞中SOD活性的增加并不明显；高浓度胁迫下，随着处理时间的延长SOD活性增加明显。

2.3 重铬酸钾溶液及处理时间对洋葱根尖细胞CAT活性的影响

不同浓度重铬酸钾溶液处理对洋葱根尖细胞CAT活性的影响情况见图4，不同处理时间对洋葱根尖细胞CAT活性的影响情况见图5。从图4、图5可见，洋葱根尖处理12、18、24 h后，细胞中的CAT活性随着重铬酸钾溶液浓度的增加呈现先上升、后下降的变化趋势，上升的趋势较下降缓慢，在25.0 mg/L处理后达到最大值，但是处理6 h后的CAT活性变化不大。随着处理时间的延长，对照的变化不明显，其他处理呈现上升的趋势，当处理浓度为12.5、25.0 mg/L时，变化较高浓度处理的明显。

2.4 重铬酸钾溶液及处理时间对洋葱根尖细胞GST活性的影响

不同浓度重铬酸钾溶液处理对洋葱根尖细胞GST活性的影响情况见图6，不同处理时间对洋葱根尖细胞GST活性的影响情况见图7。从图6、图7可知，在低浓度重铬酸钾溶液胁迫下，细胞中的GST活性缓慢上升，随著处理浓度的进一步增加，细胞中GST活性出现缓慢下降。当处理时长为6、18、24 h时，细胞中的GST活性均在25.0 g/mL处理达到峰值，而当处理时长为12 h时，细胞中GST活性在50.0 g/mL处理的活性最强。在处理浓度相同的条件下，随着处理时间的延长，低浓度胁迫下的细胞中GST活性增加明显，高浓度胁迫下GST活性变化并未呈现一定的规律。

2.5 重铬酸钾溶液及处理时间对洋葱根尖细胞MDA含量的影响

不同浓度重铬酸钾溶液处理对洋葱根尖细胞MDA含量的影响情况见图8，不同处理时间对洋葱根尖细胞MDA含量的影响情况见图9。从图8、图9可见，随着处理浓度的增加，细胞中MDA含量均呈现先缓慢下降、后迅速升高的变化。在25.0 g/mL处理达到最小值。当处理浓度相同时，除重铬酸钾溶液浓度为12.5、25.0 mg/L无明显变化规律外，其他各处理随着时间的延长，细胞中MDA含量缓慢下降。

3 讨论

科技的进步给人们生活提供了不少便利，但是也给环境造成了不同程度的损害，重金属污染就是其中之一。重金属在生物体内蓄积而不被降解的特性最终导致了生物体的畸变与变异。试验中在不同浓度重铬酸钾溶液毒害下，洋葱根尖细胞出现了染色体桥、染色体不同步甚至导致了微核的形成等变异现象[10，11]，印证了铬作为环境中毒害性较大的重金属元素对植物有一定的毒害作用，可以诱导植物的畸变与突变[12，13]；但是不同浓度、不同时间处理后洋葱根尖细胞有丝分裂过程中的微核率差别不大，也与油菜根尖细胞的微核率和染色体畸变率在一定胁迫浓度范围内呈现先上升、后下降的趋势[14]不符合，可能是由于植物种类的不同造成的。产生细胞染色体畸变的原因有很多[15]，其中主要的原因是直接抑制DNA分子，破坏了DNA分子结构，或者抑制了DNA分子向RNA分子和蛋白质的转变过程，最终导致染色体的变异；此外，还可以直接作用于染色体的分离过程，导致染色体的重排、滞后以及染色体桥的形成，滞后的染色体单独成型导致单微核、双微核的形成[16]。因此，可以通过计算细胞微核率来间接反映重金属等对细胞的毒害程度[17]。试验中，细胞出现了染色体片段的断裂以及染色体桥的形成，说明铬元素可能是作用于染色体的DNA分子而发挥毒害作用的，但是具体的毒害机理还需进一步的验证。

重铬酸钾溶液对洋葱的胁迫除了通过作用于蛋白质使蛋白质变性、从而改变细胞的膜功能外，还可以通过破坏洋葱体内的保护酶系统（SOD、CAT、GST）导致细胞内活性氧代谢障碍，使自由基积聚，从而造成洋葱出现不可逆的损伤[18]。铬元素对洋葱的生理生化反应呈现二重性，在低浓度作用下有一定的刺激作用。在重金属轻度胁迫下，植物会由于应激本能而产生保护作用，通过加速体内的新陈代谢来缓解重金属的毒害作用，但同时体内代谢功能的增强也会加速重金属进入体内，进而加重重金属的毒害。当重金属胁迫作用进一步加大后，植物本能应激产生的保护作用减弱，重金属的毒害加重，最终导致植物出现不可逆的损伤。试验结果表明，在低浓度时，SOD、CAT、GST活性增强，其原因是由于此时相比重金属的毒害作用，洋葱应激产生的保护作用占优势；而高浓度时，SOD、CAT、GST活性受到抑制则是洋葱受到重金属铬元素持续的毒害作用所致。这与以往报道的研究结果[19]相符合。随着处理时间的延长，细胞中SOD、CAT、GST活性增强，表明在处理时间为6～24 h之内，洋葱可以通过加速体内的代谢来缓解重金属铬的毒害作用。

丙二醛（MDA）是细胞内膜脂过氧化或脱脂过程的产物，它会严重损伤细胞的生物膜，而膜脂过氧化是在膜脂不饱和脂肪酸中发生的一系列自由基反应[20]。有研究发现，膜脂过氧化会导致大量活性氧自由基的产生，破坏细胞膜结构功能的稳定性[21]。本试验中，洋葱根尖细胞随着处理铬浓度的上升，其MDA含量呈现先缓慢下降、后急剧上升的变化趋势，其中MDA含量缓慢下降主要是由于有机酸产生体外解毒效果，使体内各种保护酶活性增强，加速了清除活性氧自由基的过程，削弱了膜脂过氧化作用，从而减少了MDA在体内的累积；其次是机体内保护酶系统（SOD、CAT、GST）受到抑制后，也可表现出MDA含量的降低；而MDA含量上升则是细胞膜脂过氧化作用强化的结果。这个结果与杨文玲等[21]报道的情况相类似。

试验结果表明，洋葱根尖受到重金属铬胁迫后，细胞有丝分裂过程会有染色体桥、染色体不同步甚至微核等现象的产生，最终导致细胞异常分裂、生物畸变的形成；而这种异常分裂机制与机体内酶系统（SOD、CAT、GST）活性及MDA含量的变化有着密切关系。但是重金属铬胁迫具体是通過何种途径对洋葱的酶系统产生影响还不是很清晰，而且影响植物酶系统的机理相对较复杂，还有待于下一步深入研究。

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