一株海水氨氮降解菌的分离、筛选与鉴定

2017-05-26刘世昌李彦芹李凤超康现江

河北渔业 2017年4期

关键词：筛选

刘世昌　李彦芹　李凤超　康现江

摘要：从秦皇岛对虾养殖池采集底泥，通过富集、分离、纯化，筛选出4株具有氨氮降解能力的菌株，其中菌株F1508对氨氮的去除能力最强，其24 h和48 h的氨氮去除率分别为81.87%和97.74%。对菌株F1508进行了生理生化鉴定和16S rRNA同源性序列分析，结果表明菌株F1508与迈索尔节杆菌Arthrobacter mysorens序列相似性为99%。

关键词：氨氮降菌解；筛选；生理生化鉴定

随着水产养殖业的不断发展，养殖水体污染不断增加[1]。水体中氨氮是危害水产养殖动物健康生长的主要理化因子之一[2]，研究表明生物脱氮是去除水体氨氮污染物最有效方法之一[3]。一直以来，硝化-反硝化模式是处理含氮污染废水的主要路线，在硝化过程中，硝化细菌在起主要作用[4]，而硝化作用过程中占据主要地位的是自养型硝化细菌[5]。近年来研究表明，有些异养微生物也能进行硝化作用，如芽孢杆菌属（Bacillus sp.）[6]、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）[7]、副球菌属（Paracoccus sp.）[8]等。

本实验从对虾养殖池底泥取得样品，通过富集、分离、纯化，筛选出一株具有较强去除氨氮能力的异养硝化细菌F1508，对其进行生理生化鉴定和16S rRNA 同源性序列分析，以期为该菌株在生产中的应用提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源实验样品采集于秦皇岛对虾养殖池底泥。

1.1.2 培养基

LB培养基（g/L）：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 30.0，pH：7.0～7.2。

富集培养基（g/L）：柠檬酸钠5.0，（NH4）2SO4 2.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.2，NaCl 30.0，pH：7.0～7.2。

异养硝化培养基（g/L）：（NH4）2·SO4 0.47，柠檬酸钠8.2，NaCl 30，pH：7.0～7.2；50mL维氏盐溶液。

维氏盐溶液（g/L）：K2HPO4·3H2O 5.0，FeSO4·7H2O 0.05，MgSO4·7H2O 2.5， MnSO4·4H2O 0.05。

1.2 方法

1.2.1 氨氮降解菌的富集分离分装100 mL 富集培养基于500 mL 三角瓶，加入玻璃珠数粒，灭菌后加入25 mL 泥样，20 ℃，150 r/min 振荡培养2～3 d。吸取富集液25 mL 接入新的富集培养基中，如上条件培养2～3 d，反复操作3次，以富集目的菌。

取10 mL 上述富集培养液至90 mL 无菌水中，梯度稀释，涂布于LB平板，20 ℃培养2～3 d。从LB平板上挑取单菌落，经过5輪划线，纯化得到纯培养物，转接到试管斜面。斜面培养2～3 d 备用。

1.2.2 氨氮降解菌筛选接斜面菌种2环到装有100 mL LB液体培养基的250 mL三角瓶中，150 r/min活化24 h；再将活化的菌液按5%的接种量接到装有100 mL的异养硝化培养基的250 mL的三角瓶，20 ℃，150 r/min摇瓶48 h，每隔24 h测定一次氨氮浓度。

采用纳氏试剂分光光度法[9]测定氨氮浓度。测定氨氮浓度时，培养液需8 000 r/min 离心10 min，吸取上清液测定。

脱氮率（A）的计算公式：A=（c1-c2）/c1，其中c1为体系中所添加氨氮的初始浓度，c2为培养后体系中剩余氨氮浓度。

1.2.3 菌株鉴定形态及生理生化鉴定：20 ℃培养48 h，观察菌落形态；革兰氏染色显微镜下观察菌体形态，生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》[10]。

16S rDNA 序列测定：将筛选得到的菌株保存斜面送往北京美吉生物医药有限公司测序。

1.2.4 生长曲线的测定从斜面培养基上挑取一环到装有30 mL LB 培养基的三角瓶中活化12 h，将活化好的按5%的接种量接种到装有100 mL LB 培养基三角瓶中，每隔3 h测定OD值。

2 结果与分析

2.1 氨氮降解菌的富集分离与筛选

将对虾养殖池底泥接入富集培养基进行富集培养，之后再接入LB培养基，经过5轮划线培养进行分离，最终获得能在LB固体培养基上生长的纯菌株4株，分别编号为F1502、F1504、F1507、F1508。

将分离得到4株菌株接入异养硝化培养基中，培养后测定各组培养基中氨氮的浓度，计算脱氮率，见表1。如表1所示，菌株F1508对氨氮降解效率最高，24 h和48 h的氨氮去除率分别为81.87%和97.74%，因此作为后续研究对象。

2.2 菌株F1508鉴定

菌株F1508形态特征：细胞呈杆状，革兰氏阳性，菌落圆形，边缘整齐规则，不透明，菌落浅黄色，菌落直径0.5～1 mm。菌株F1508的生理生化特征见表2。菌株F1508能够利用葡糖糖和蔗糖发酵，能够产生淀粉酶，利用柠檬酸盐，不能分解明胶。该菌株能与H2O2反应产生气泡，呈接触酶阳性。该菌株在吲哚、VP色素实验中，吲哚实验为阴性，VP实验为阳性。氧化酶实验呈阴性。

分离菌株F1508经16S rRNA测序后与菌株Arthrobacter mysorens （GenBank中的登录号为AJ639831.1）进行同源性比较，同源性达99%，结合菌株的形态学及生理生化实验结果，可初步判定所筛选菌株F1508为节杆菌属（Arthrobacter sp.）。

2.3 生长曲线

菌株F1508的生长曲线见图1。由图1可见，菌株F1508在0～3 h处于调整期，OD值呈缓慢增长的趋势，在LB培养基中经过短暂适应，3 h后进入对数生长期，OD值呈对数增长，20 h后进入稳定期，OD值变化趋于平缓。

图1 菌株F1508的生长曲线

3 讨论与结论

水产养殖中氨氮的积累与众多的微生物代谢活动相关，不仅影响鱼类等水生生物的生长，甚至会导致水体富营养化，引起水质恶化，污染环境。

近年来，国内外陆续有大量氨氮降解菌被分离出来，多应用于生活和工业污水处理，但水产养殖中可以应用的脱氮菌株相对较少。如廖小红等从高溶解氧條件下驯化的SBR曝气反应器中筛选出的蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）WXZ-8的氨氮去除率最高达96.06%[11]。研究表明，能够进行硝化作用的菌株多为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）[7]、副球菌属（Paracoccus sp.）等，然而在节杆菌属中具有氨氮降解能力的细菌报道相对较少。

目前我国海水养殖废水生物处理研究大多还停留在实验室阶段，水产养殖应用方面相对较少。因此针对河北省水产养殖特定情况，分离筛选出适应性强的本土土著菌群，可显著提高微生物的数量，快速生产出适宜净化本土水质环境的菌群，提高菌群的成活率、利用率和处理效果。

本实验在好氧条件下，分离筛选出1株高效氨氮降解菌F1508，去除率为97.74%。

经16S rDNA 同源性分析及形态观察、生理生化鉴定，初步判定菌株F1508属于节杆菌属（Arthrobacter sp.）。

参考文献：

[1]

张峰峰，谢凤行，周可，等.一株高氨氮去除能力菌株的分离筛选及鉴定[J].华北农学报，2014，29（4）：221-225

[2] 张家顺，苏真真，薛菲菲，等.2株氨氮去除菌的分离鉴定及去除率影响因素分析[J].水产学报，2015，39（10）：1549-1557

[3] 李彦芹，李春青，管鹏悦，等.一株好氧反硝化菌的分离鉴定及脱氮条件研究[J].环境科学与技术，2015（7）：33-37

[4] 刘芳芳，周德平，吴淑杭，等.养殖废水中异养硝化细菌的分离筛选和鉴定[J].农业环境科学学报，2010，29（11）：2232-2237

[5] 王弘宇，马放，杨开，等.两株异养硝化细菌的氨氮去除特性[J].中国环境科学，2009，29（1）：47-52

[6] 郭强，杨云龙，陈宏平.一株地衣芽孢杆菌异氧硝化-好氧反硝化特性研究[J].环境科学与技术，2015（7）：38-42

[7] Koschorreck M，Moore E，Conrad R.Oxidation of nitric oxide by a new heterotrophic Pseudomonas sp.[J].Archives of Microbiology，1996，166（1）：23-31