血瘀型噎膈患者血清对食管癌EC9706细胞周期及核因子-κB信号通路蛋白表达的影响

林 清 贾永森 张艳丽 杨晓利 秦丽娟 马会霞 江春花

(华北理工大学中医学院,河北 唐山 063000)

血瘀型噎膈患者血清对食管癌EC9706细胞周期及核因子-κB信号通路蛋白表达的影响

林 清 贾永森 张艳丽1杨晓利2秦丽娟3马会霞 江春花

(华北理工大学中医学院,河北 唐山 063000)

目的 通过观察血瘀型噎膈患者血清对食管癌EC9706细胞周期及核因子(NF)-κB介导的信号通路蛋白表达的影响。方法 将EC9706细胞于37℃，5%饱和湿度的CO2培养箱孵育24 h，饥饿24 h，分别加入倍比梯度的血瘀证、脾气虚证患者和健康人血清，MTT染色法检测细胞增殖变化；PI染色法观察细胞周期变化； Western印迹法检测NF-κB信号通路蛋白的表达。结果 血瘀型噎膈患者血清刺激细胞的50%增殖率为711 μl/10 ml培养液体积；细胞周期分析，患者血清刺激的EC9706细胞(38.85±3.11)% 处于S增殖期，与各对照组有显著差异(P<0.05)；在NF-κB信号通路中，血瘀型噎膈患者血清对EC9706细胞蛋白IKK-β、NF-κB、磷酸化NF-κB、肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达具有特征性促表达作用，与其他各血清干预的细胞比较有显著差异(P<0.05)。结论 噎膈血瘀证患者血清提供利于细胞增殖的微环境，该证候的分子机制与细胞周期调节和NF-κB信号通路蛋白超表标达密切相关。

食管癌；血瘀证；血清；EC9706细胞；核因子-κB；信号通路

噎膈是以进食时吞咽困难、哽咽不顺、饮食难下或食入即吐为主症的疾病，与现代疾病的食管癌的表现十分相似〔1〕。中医临床研究表明食管癌患者几乎都有血行不畅、瘀血内停的病机变化，表现为肿、痛、舌质暗紫或瘀斑等。实验室检查也显示患者血液流变学指标增高，患者血液处于明显高凝状态〔2〕，因此血瘀是食管癌形成发展的主要病机之一。研究表明，食管癌细胞的增殖、浸润与核因子(NF)-κB介导的信号通路蛋白超表达有关〔3，4〕。本研究进一步从食管癌血瘀病机的角度，观察了临床确诊的血瘀型噎膈患者血清对食管癌EC9706细胞周期及NF-κB信号通路蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 人血清 从遵化市人民医院、迁安燕山医院肿瘤内科筛选病理确诊食管癌患者，3名独立调查员按照拟定的“噎膈证候调查表”执行辨证，确定血瘀证、脾气虚证患者各10例；另选取健康志愿者10例，所有入选病例均签署患者知情同意书，并取得华北理工大学医学伦理审查委员会审查报告。抽取患者和健康人晨起空腹血10 ml，室温静置30 min，3 000 r/min 4℃离心15 min，56℃水浴灭活，去除补体等成分，上清液于-80℃冰箱保存备用。

1.2 试剂 RPMI1640培养基、胎牛血清(BCS)、胰蛋白酶(Gibco公司)；MTT、DMSO(Amresco公司)；RNase A、碘化丙啶(PI，Sigma公司)；IKK-β多克隆抗体；NF-κB多克隆抗体；磷酸化NF-κB (Phospho-NF-κB)多克隆抗体；肿瘤坏死因子(TNF)-α单克隆抗体(CST公司)；山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP(华美生物工程公司)。

1.3 细胞 人食管癌EC9706细胞株(购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)。

1.4 仪器 1100型单人超净工作台(Forma公司)，NOVAPATH 450酶标光度计(Bio-Tek公司)，JY92-IID超声波细胞破碎仪(新芝公司)，3336 CO2培养箱(Forma公司)，TMD-2倒置式显微镜(Nikon公司)，3MK型低温高速离心机(Sigma公司)；Facscdlibur流式细胞仪(BD公司),垂直电泳仪(AE-6531,Atto公司)；凝胶扫描分析系统(Gel-doc-2000，Bio-Rad公司)。

1.5 方法

1.5.1 细胞培养 以10%BCS RPMI1640培养液10 ml，接种EC9706细胞于Φ100 mm培养皿中，置于37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱孵育。

1.5.2 MTT法测定人血清影响EC9706细胞的半数增殖量 以1×104个细胞/孔的密度接种于96孔平面培养板，含10%BCS培养液使细胞贴壁24 h后，去除BCS，饥饿细胞24 h，随机选取血瘀证、脾气虚证患者和健康志愿者血清各1例，以RPMI1640培养液配制如下梯度浓度：31.25，62.50，125.00，250.00，500.00，1 000.00 μl/10 ml孵育细胞；空白对照组以不含血清培养液孵育细胞作为平行对照。每组均设置3个复孔，继续培养48 h。去上清液，每孔加100 μl含有0.2 mg/ml MTT自由培养液，37℃继续培养4 h，去上清，加入150 μl DMSO溶解MTT，摇床上混匀15 min，酶标仪上以570 nm/630 nm测定光密度值(OD值)。随后再随机选取各组人血清，重复实验4次。按照公式：肿瘤细胞生长增殖率=(实验组OD值/对照组OD值-1)×100%，计算各血清组对肿瘤细胞生长的增殖率，求出3组人血清的50%细胞增殖浓度值(PI50)。

1.5.3 细胞周期测定 以1×106/皿细胞密度接种EC9706细胞于Φ100 mm培养皿中，贴壁24 h，分别加入含有PI50浓度的三组人血清RPMI1640培养液，孵育24 h，收集入15 ml离心管中，PBS 2 ml重悬细胞，加入70%乙醇固定细胞，4℃过夜。弃掉乙醇，并在3 ml预冷的PBS中重悬细胞，再离心,弃掉PBS，依次加入PBS 850 μl，10 g/L RNaseA 10 μl，1%Triton X-100 100 μl，1 g/L PI 40 μl,37℃下避光孵育5 min〔5〕。400目筛网过滤细胞，上流式细胞仪分析细胞周期，并用Modifit LT软件分析结果，得出不同组别细胞在各细胞周期的百分比率。

1.5.4 蛋白提取 将空白对照组、3组人血清干预的细胞冰上收集，离心，裂解细胞；15 000 r/min离心20 min；取上清。Bradford法测蛋白浓度，-20℃保存备用。配8%SDS-PAGE(分离胶)和积层胶。

1.5.5 Western印迹分析方法 灌胶、上样、电泳，转移过夜。转移结束后，加丽春红染料染色，标记标准蛋白分子量。加封闭液在摇床上振摇1 h，阻断膜上的非特异性结合位点；抗原抗体反应；加入ECL显色液，X线摄片。

1.6 统计学方法 采用SPSS18.0软件进行F检验，采用Image J图像分析软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 血清对食管癌EC9706细胞增殖的影响 6个不同梯度的人血清浓度加入RPMI1640培养液中孵育细胞，3组血清干预的食管癌EC9706细胞均呈增殖态势，但血瘀证组、脾气虚证组人血清浓度与细胞增殖呈近似立方关系，而健康志愿者血清组呈近似线性关系。血瘀证组PI50=711 μl/10 ml，脾气虚证组PI50=1 180 μl/10 ml，健康志愿者组PI50=1 243 μl/10 ml。见表1。

2.2 人血清对EC9706细胞生长周期的影响 细胞周期流式细胞术检测结果显示，空白对照组、脾气虚证患者血清组和健康志愿者血清组细胞周期分布无显著性差异(P>0.05)。血瘀型噎膈患者血清组细胞G1期细胞明显减少；S期细胞比率明显增高，与其他三组比较有显著差异(P<0.05)。见表2。

表1 人血清对食管鳞癌EC9706细胞增殖影响的量效关系

表2 人血清对EC9706细胞周期的影响

与其他三组比较：1)P<0.05；下表同

2.3 人血清对EC9706细胞NF-κB信号通路蛋白表达的影响 Western印迹法分析显示，两组噎膈患者血清干预的食管癌EC9706细胞，NF-κB信号通路蛋白表达均不同程度地增强。血瘀证组与空白对照组比较，IKK-β、NF-κB、磷酸化NF-κB和TNF-α蛋白相对灰度值均显著增强(P<0.05)；与脾气虚证组比较， 4个蛋白表达相对值呈显著差异(P<0.05)。结果表明，血瘀型噎膈患者血清对EC9706细胞NF-κB通路蛋白条带表达具有较强促进作用。见表3和图1。

表3 人血清影响EC9706细胞NF-κB信号通路各蛋白表达相对灰度值

A.空白对照组；B.血瘀证组；C.脾气虚证组；D.健康志愿者组 图1 人血清对EC9706细胞 NF-κB信号通路蛋白表达的影响

3 讨 论

血液中多种物质直接影响肿瘤发生与发展，近年来有关研究多集中在单一血液成分如细胞因子等对肿瘤作用的机制，也有用含药动物血清观察其对肿瘤干预的研究，但从整体上研究血液内环境对肿瘤患者中医证候形成作用的报道甚少。如同其他恶性肿瘤一样，食管癌的发生、不同证候的形成与患者血液微环境关系密切。中医认为，血行脉中赖气以推动，故有气以行血之论。气虚则不能行血，血流滞涩而导致血瘀证，这种内在机制为血瘀的形成奠定了基础。临床资料也表明食管癌患者大多存在脾气虚的证候特征，可以看出，脾气虚证与血瘀证在食管癌病变中存在密切关系。本研究表明脾气虚证患者和健康人的血清对癌细胞的刺激作用较小。

细胞周期调控异常是癌变的重要机制，恶性肿瘤细胞的周期调控失控使细胞正常分化受阻，从而处于过度增殖状态〔6〕。周期中S期的比例反映了肿瘤细胞群体中处于增殖阶段的数量，从一定程度上代表了细胞增殖状态〔7〕。本研究结果表明，血瘀证噎膈患者血液内环境刺激食管癌细胞增殖与调节细胞周期有关，它有力促进了细胞进入活跃S期。

在许多人类癌症包括食管癌在内，NF-κB信号通路的激活对肿瘤的发生发展中起着重要的作用〔7〕。该蛋白家族是一种多效性的转录因子，可以与多种基启动子部位的κB位点发生

特异性的结合从而促进其转录表达。很多胞外刺激信号都可以引起NF-κB 信号通路的激活，如：促炎症细胞因子白介素IL-1，病毒双链RNA 以及各种物理和化学压力等〔8〕。虽然这些胞外刺激所产生的胞内早期信号途径各不相同，但一般认为，大多数此类胞外刺激起始的信号传递反应将最终激活IKK复合物，其中IKK-β是促炎症反应因子刺激诱导NF-κB 的激活的主要激酶。NF-κB被激活后，可启动下游分子如TNF-α等，从而促进肿瘤细胞增殖和浸润。

本研究结果表明，以脾气虚证为代表的噎膈常见证候患者血清对食管癌细胞的NF-κB信号通路刺激作用较弱，与之相对的，血瘀型噎膈患者的血清对NF-κB信号通路各蛋白具有特征性促表达作用。

1 周岱翰.临床中医肿瘤学〔M〕.北京：人民卫生出版社，2003：152.

2 毛元英,何 兰,杨红英.肿瘤患者血液流变学指标检测结果分析〔J〕.检验医学与临床,2014；11(3):337-8.

3 田同德,储真真,陈信义.恶性肿瘤高凝状态与血瘀证相关性及中医防治对策研究〔J〕.北京中医药,2009；28(6):425-7.

4 贾永森,李继安,杜 宁,等.通莲I号方对食管癌Eca109细胞NF-κB信号通路影响的研究〔J〕.时珍国医国药,2012；23(10):2534-5.

5 Xue JY，Zhou GX，Chen T，etal.Desacetyluvaricin induces S phase arrest in SW480 colorectal cancer cells through superoxide overproduction〔J〕.J Cell Biochem，2014；115(3):464-75.

6 Jin J,Lin G,Huang H,etal.Capsaicin mediates cell cycle arrest and apoptosis in human colon cancer cells via stabilizing and activating p53〔J〕.Int J Biol Sci，2014；10(3):285-95.

7 Tian F,Zang WD,Hou WH,etal.Nuclear factor-κB signaling pathway constitutively activated in esophageal squamous cell carcinoma cell lines and inhibition of growth of cells by small interfering RNA〔J〕.Acta Biochim Biophys Sin,2006;38(5):318-26.

8 赵 静.EGFR和NF-κB p65在食管癌组织中的表达及其它们的相互关系〔D〕.石家庄：河北医科大学，2009.

〔2015-08-21修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

河北省自然科学基金(H2013209053)

贾永森(1978-)，男，医学博士，副教授，硕士生导师，主要从事肿瘤疾病中医方证基础研究。

林 清(1983-)，女，讲师，硕士，主要从事中医基本理论与临床应用研究。

R273

A

1005-9202(2017)09-2107-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.011

1 迁安燕山医院 2 遵化市人民医院 3 华北理工大学基础医学院