不同预处理对灵芝多糖提取效果的影响

梁晋谊 周敬豪 周健平 谭毅峰 许克勇

（开平健之源保健食品有限公司，广东开平529321）

灵 芝为 赤芝 Ganoderma lucidum（Leyss.ex.Fr）Karst的子实体[1]，属多孔菌科真菌[2]，临床上可用于辅助化疗或放疗治疗肿瘤，慢性支气管炎与哮喘，神经衰弱失眠，高血脂症，高血压病，糖尿病，肝炎，白细胞减少症，毒蘑菇中毒等方面治疗或辅助治疗[3]。灵芝含有多种功效活性成分，其中灵芝多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、降血脂、保护神经细胞[4]等多方面的生理活性，是灵芝中最重要的活性成分之一，为灵芝保健及药用价值开发重要的功效物质基础。

灵芝干燥后多呈近革质或木栓质至木质的结构[5]，子实体菌丝壁厚粗大，交织缠绕，具有由葡聚糖、几丁质、纤维素、半纤维素、木质素、蛋白质等构成的四层结构细胞壁，质地坚韧，机械强度高，耐压、耐温、耐酸、耐碱，对消化酶也非常稳定，里面的多糖等功效物质难以充分地被提取利用。目前通过提取方法的改进提高灵芝多糖得率的研究及报道较多，但少有对灵芝提取前预处理方式进行研究的。研究对比了不同预处理方式，以及最佳预处理方式结合不同提取方法对灵芝多糖提取效果的影响，旨在寻找一种最优的预处理方法，为灵芝多糖的提取利用研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 供试灵芝 取自开平健之源保健食品有限公司灵芝基地，烘干处理，经中国科学院微生物研究所鉴定为Ganoderma lucidum灵芝（赤芝），生产批号：160301C。

1.1.2 试剂 葡聚糖标准品，购于中国计量科学研究院；复合纤维素酶（Celluclast），诺维信公司；食用菌水解酶A01、木瓜蛋白酶，广西南宁庞博生物工程有限公司；磷酸二氢钠、氢氧化钠、五水合硫酸铜、柠檬酸钠、无水硫酸钠、氨水、无水乙醇、浓硫酸、苯酚，均为分析纯。

1.2仪器设备木粒粉碎机，广东阳山机械厂；爪式粉碎机，广东阳山机械厂；气流粉碎机，昆山强威粉体设备有限公司；KQ2200DA型数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；P70D20TP-C6（WO）格兰仕微波炉，广东格兰仕微波炉电器制造有限公司；电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；HHS型电热恒温水浴锅，天津市华北实验仪器有限公司；RE-5205旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D（III）循环水式多用真空泵，河南省予华仪器有限公司；DZF水式多用型真空干燥箱，上海浦东荣丰科学仪器有限公司；TGL-16B高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；Uvmini-1240紫外可见分光光度计，津岛公司；Waters 1525高效液相色谱仪。

1.3方法

1.3.1 灵芝粗粉碎 用木粒粉碎机将灵芝干燥子实体打成粗粒，再用爪式粉碎机将粗粒粉碎，过10目筛网。

1.3.2 灵芝预处理及提取 取经过粗粉碎的灵芝粉末样品，分别进行以下操作。

1.3.2.1 直接提取 取4份样品各100 g，分别加入1000 mL水，微沸提取2 h，过滤收集滤液，滤渣同条件再次提取，合并两次滤液，真空浓缩干燥（温度：60℃，真空度：-0.090 MPa），得灵芝提取物，计算粗收率、多糖含量及多糖得率。

1.3.2.2 浸泡预处理及提取 取4份样品各100 g，分别加入1000 mL水，搅拌1 min后静置，常温浸泡16 h，然后微沸提取2 h，其它处理同上。

1.3.2.3 微波预处理及提取 取4份样品各100 g，分别滴加质量比15%的乙醇[6]，边加边搅拌均匀，然后置于微波炉中设置中低火处理3 min，取出后加入1000 mL水，微沸提取2 h，其他处理同上。

1.3.2.4 气流精细粉碎预处理及提取 取20 kg样品投入气流粉碎机中进行精细粉碎（进料速度3 kg/h，工作压力0.8 MPa，设备气量2 m3/min），过40目筛网，取4份样品各100 g，加入1000 mL水，微沸提取2 h，其他处理同上。

1.3.3 气流精细粉碎预处理结合不同方法提取灵芝多糖

1.3.3.1 热水提取 同1.3.2.4方法。

1.3.3.2 醇提取 取1.3.2.4所得灵芝精粉4份样品各100 g，根据前期实验所得最优条件，分别加入1000 mL 2%乙醇，70℃提取2 h，过滤收集滤液，滤渣同条件再次提取，合并两次滤液，其他处理同上。

1.3.3.3 碱提取 取1.3.2.4所得灵芝精粉4份样品各100 g，根据前期实验所得最优条件，分别加入1000 mL 1%氨水溶液，微沸提取2 h，过滤收集滤液，滤渣同条件再次提取，合并两次滤液，其他处理同上。

1.3.3.4 超声波结合酶提取 取1.3.2.4所得灵芝精粉4份样品各100 g，根据前期实验所得最优条件，分别加入1000 mL水，同时加入0.6 g复合纤维素酶、0.1 g食用菌水解酶A01、0.6 g木瓜蛋白酶，超声提取1 h，过滤收集滤液，滤渣同条件再次提取，合并两次滤液，其他处理同上。

1.3.3.5 微波提取 取1.3.2.4所得灵芝精粉4份样品各100 g，根据前期实验所得最优条件，分别加入1000 mL水，置于微波炉中设置中低火（150 W）提取15 min，过滤收集滤液，滤渣同条件再次提取，合并两次滤液，其他处理同上。

1.3.4 分析方法

1.3.4.1 粗收率计算 粗收率（%）=灵芝提取物重量（g）/灵芝投料量（g）×100

1.3.4.2 多糖含量测定 分光光度测定法，以葡聚糖为标准品绘制标准曲线[7]。

1.3.4.3 多糖得率计算 多糖得率（%）=粗收率（%）×多糖含量（%）×100

1.3.4.4 多糖高效液相色谱检测分析

1.3.4.4.1 高效液相色谱检测 采用凝胶渗透色谱法对样品中的多糖进行检测分析。色谱条件：UltrahydrogelTM250 GPC柱，7.8 mmhydrog；流动相为纯净水；柱温：30℃；流速：0.6 mL/min；进样量：20 μL；检测器：2420蒸发光散射检测器。

1.3.4.4.2 样品溶液制备 精密称取1 g试样（灵芝提取物），加水定容至100 mL，摇匀，滤过，准确吸取滤液5 mL，加入20 mL无水乙醇，醇沉静置5 min，离心15 min（5000 r/min），去上清，用80%乙醇离心洗涤沉淀物1次，沉淀物定容至5 mL水，作为供试样品溶液，进样前用0.45 μm水相针式过滤器过滤。

2 结果与分析

2.1不同预处理方法对灵芝多糖提取效果的影响由表1可知，直接提取与浸泡预处理、微波预处理后提取相比，粗收率、多糖含量、多糖得率的变化均较小，即浸泡预处理及微波预处理对灵芝多糖提取效果的影响不明显，而气流精细粉碎预处理能大幅提高提取物中的灵芝多糖的含量及得率，与直接提取相比，多糖含量提高114%，多糖得率提高104%。

表1 不同预处理方法对灵芝多糖提取效果的影响

2.2气流精细粉碎预处理结合不同方法提取灵芝多糖由表2可知，气流精细粉碎预处理结合碱提取获得灵芝多糖的效果最佳，与表1的灵芝粗粉碎后直接提取相比，粗收率提高76%，多糖含量提高78%，多糖得率提高215%。气流精细粉碎预处理结合醇提取、超声结合酶提取及微波提取，相对于结合传统的热水提取方法，提取灵芝多糖的效果没有明显提高，并且超声波结合酶提取甚至导致多糖含量及多糖得率的下降，也可能是处理条件未达到最优效果所致。热水提取方法对设备要求不高，条件容易掌握，生产应用普及率高，无有机溶剂回收、产品中残留及对环境的污染等问题，超微粉碎预处理结合传统热水提取方法即能大幅提高灵芝多糖的提取效果，故具有较强的生产实践意义。

2.3灵芝多糖液相色谱检测由图1可知，气流精细粉碎预处理后热水提取的多糖物质峰型特征（b）与直接提取的（a）比较接近，出峰时间、各峰面积之间的比例都比较相似，总体峰面积为b＞a。推测气流精细粉碎预处理后热水提取跟直接提取相比，在提取灵芝多糖的效果方面，主要是在不明显改变提取所得多糖的种类及互相之间比例的前提下，提高提取物中灵芝多糖的总体含量，从而使灵芝多糖得率提高，使提取更加充分完全。而气流精细粉碎预处理结合碱提取的多糖特征图谱（c），与直接提取相比变化较大，出峰的峰型明显改变，提示提取所得灵芝多糖的性质发生了改变。

表2 气流精细粉碎预处理结合不同方法提取灵芝多糖

图1 不同灵芝提取物样品的多糖液相特征图谱

3 结论与讨论

（1）对比浸泡、微波、气流精细粉碎等预处理方式对从灵芝子实体中提取灵芝多糖效果的影响，其中气流精细粉碎预处理能大幅提高灵芝多糖的提取效果，对比灵芝直接提取，粗收率变化较小，而多糖含量提高114%，多糖得率提高104%。

（2）考察气流精细粉碎预处理结合热水提取、醇提取、碱提取、超声波结合酶提取、微波提取等提取方式在灵芝多糖提取方面的效果，最佳的组合方式为气流精细粉碎预处理结合碱提取，可使粗收率提高76%，多糖含量提高78%，最终多糖得率提高215%。

（3）通过对不同处理方法所得灵芝提取物的多糖特征图谱进行比较分析，认为气流精细粉碎预处理对灵芝多糖提取效果的影响，主要是提高提取物中灵芝多糖的总体含量，从而使多糖得率提高，使提取更加充分，而对所提取多糖的种类及互相之间的比例影响不大。

（4）气流精细粉碎预处理能大幅提高灵芝多糖的提取效果，且对所提取多糖性质的影响较小，推测气流粉碎预处理主要是破环了灵芝精粉的机械支撑壁膜结构，使细胞内功效物质的溶出更加完全，这方面内容将在后续实验开展中进行研究分析。