C8-oxo-HSL对P. aeruginosa在污水处理中生长特性影响

周礼杰,王 鑫,韩 倩,朱婷婷,成 功,夏四清*(.深圳市环境科学研究院,国家环境保护饮用水水源地管理技术重点实验室,深圳市饮用水水源地安全保障重点实验室,深圳市水环境中新型污染物检测与控制重点实验室,广东 深圳 5800；2.深圳大学化学与环境工程学院,广东 深圳 58060；.同济大学环境科学与工程学院,污染控制与资源化研究国家重点实验室,上海 200092)

C8-oxo-HSL对P. aeruginosa在污水处理中生长特性影响

周礼杰1,2,3,王 鑫3,韩 倩1,朱婷婷1,成 功1,夏四清3*(1.深圳市环境科学研究院,国家环境保护饮用水水源地管理技术重点实验室,深圳市饮用水水源地安全保障重点实验室,深圳市水环境中新型污染物检测与控制重点实验室,广东 深圳 518001；2.深圳大学化学与环境工程学院,广东 深圳 518060；3.同济大学环境科学与工程学院,污染控制与资源化研究国家重点实验室,上海 200092)

通过24孔板序批实验对群体效应(QS)信号分子C8-oxo-HSL对铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)在污水处理过程中生长特性影响作用进行分析探讨.研究发现C8-oxo-HSL有效刺激P. aeruginosa大量生长,其对应的阙值浓度为10-10g/L C8-oxo-HSL.同时推知具有LuxI/R群体效应系统的革兰氏阴性菌可在较低的信号分子浓度作用下大量增殖.C8-oxo-HSL还可有效刺激P. aeruginosa分泌大量蛋白质至紧密型胞外聚合物(TB-EPS)中,其对应的阙值浓度为10-7g/L C8-oxo-HSL.但C8-oxo-HSL对P. aeruginosa的TB-EPS中多糖没有明显影响作用.C8-oxo-HSL通过促使P. aeruginosa的增殖和团聚从而增强菌胶团稳定性.此外C8-oxo-HSL可促进P. aeruginosa生物膜形成.但由于P. aeruginosa生物膜的形成同时和细菌菌量与胞外聚合物浓度直接相关.所以P. aeruginosa生物膜快速生长的C8-oxo-HSL阙值浓度相对较高(约10-8g/L).

群体效应；铜绿假单胞菌；C8-oxo-HSL；菌胶团；生物膜

氢基质生物膜反应器、好氧/厌氧颗粒污泥等都是目前新兴并且被广泛关注的新型污水处理技术,但是随着该技术研究及推广却发现了生物膜形成缓慢、颗粒污泥难以团聚等一系列问题[1-2].目前,科研人员主要通过对反应器进行如温度、pH值、营养盐、接种污泥、运行流程等调整从而改善这一情况[1-2].而随着近年来对微生物间信息交换等研究发现,微生物间的信息系统对微生物分泌胞外聚合物(EPS)、生物膜形成、细菌团聚等行为都具有关键性作用,甚至扮演者行为发生的控制角色[3].因此,污水处理领域科研工作者希望将调控微生物信息系统作为促进生物膜形成、强化颗粒污泥形成的新手段.

群体效应(Quorum sensing,QS)是微生物最为重要的信息系统,且重点控制着污水处理中微生物 EPS释放、菌胶团形成与生物膜生成等行为.近年来群体效应在污水处理系统中的作用以及相应技术的应用不断受到关注.群体效应自1977年首次随海洋发光菌Vibrio fischeri一同被报道后,一直被认为是微生物细胞内和细胞间重要的信息交流平台系统.群体效应是以微生物分泌的特殊可溶性信号分子(Autoinducer,AI)作为信号分子来监测群体密度以及协调微生物功能表达的信息交流机制,并且该机制与微生物的群体密度密切相关.群体效应基本原理为微生物体内不断对环境中积累的AI信号分子进行感知与检测,当AI浓度达到阙值(Critical threshold level)时,微生物群体系统根据AI信号类型以及其浓度做出相应的基因表达来调控微生物行为.群体效应有三类不同的调控系统,分别为利用酰基高丝氨酸内酯类分子(Acylated homoserine lactones, AHLs)作为AI的LuxI/R系统、利用修饰过的寡肽类分子作为寡肽/双组份蛋白信号系统以及其他类型AI分子的杂合型信号系统[4].

革兰氏阴性菌是污水处理中最为常见的微生物,而革兰氏阴性菌的群体效应系统为 LuxI/R系统(图1)[5].因此, LuxI/R系统是污水处理过程中最常见的微生物群体效应系统,也成为研究人员重点关注对象.李俊英等[6]提出基于群体效应原理通过外加 AHLs信号分子促进生物膜生长并提高其污水处理能力的建议.李蒙英等[3]也通过调控微生物群体效应强化生物膜的形成、孙颉等[7]通过外加LuxI/R系统信号分子(C6-HSL和C8-oxo-HSL)可有效地促进生物膜生长并增强NO2-的去除效果.此外,国外也通过利用群体效应反向调控抑制生物膜的形成.Yeon等[8]则基于群体效应机理,通过投加 AHLs淬灭剂来抑制生物膜形成从而减缓膜污染.AHLs淬灭剂抑制膜污染技术研究目前主要集中于淬灭剂选择[9]以及淬灭剂投加方式[10-11].

图1 革兰氏阴性菌的LuxI/R信号系统Fig.1 LuxI/R system of gram-negative bacteria

然而目前基于群体效应LuxI/R系统调控污水处理技术研究主要集中在生物膜形成快慢的表现上[12-13],但是就 AHLs对形成生物膜前期的微生物生长特性以及其菌胶团的影响研究甚少,而这一影响却从根本上直接制约生物膜形成快慢.此外,AHLs信号分子对微生物菌胶团团聚的研究同样较少,制约着群体效应强化颗粒污泥的调控技术发展.因此, 需就 AHLs信号分子对污水处理系统中微生物生长特性影响进行深入的分析研究.在污水处理过程中, P. aeruginosa是活性污泥中最为常见和具有降解特殊污染物能力的微生物[14-16],并且作为革兰氏阴性菌的 P. aeruginosa是典型具有LuxI/R群体效应系统的微生物[17-18].本论文选择最为常见的 C8-oxo-HSL作为AHLs信号分子以及 P. aeruginosa作为活性污泥代表性微生物,对 AHLs信号分子对微生物在污水处理中生长特性影响进行研究.

1 材料与方法

1.1 微生物菌种及培养基

本研究所使用的活性污泥常见细菌 P. aeruginosa[图 2(a)]购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC,菌种编号 23618).该菌从降解有机磷废水的活性污泥当中分离而获得.P. aeruginosa的LuxI/R系统中的信号分子主要有C4-HSL和 C12-oxo-HSL.在污水生物处理系统中,活性污泥中大部分微生物都可以 C8-oxo-HSL作为其LuxI/R系统信号分子.因此本论文选择C8-oxo-HSL作为信号分子进行研究.C8-oxo-HSL[Sigma,CAS No. 147795-39-9,结构如图2(b)]梯度溶于甲醇中并制成2×10-2和2×10-5g/L储备液(4oC保存).本研究所使用的培养基为CICC推荐培养基 A(蛋白胨 5g/L、牛肉膏 3g/L、NaCl 5g/L、pH 7.0).

图2 P. aeruginosa电镜图(10000×)与C8-oxo-HSL结构图Fig.2 Photograph of P. aeruginosa (10000×) and the structure of C8-oxo-HSL

1.2 孔板实验

本研究采用24孔板(Corning,美国)进行序批培养实验[5].P. aeruginosa经过12h培养后其生长速度将会稳定且开始形成生物膜.预实验结果也表示P. aeruginosa经37℃、160r/min培养8h后进入对数生长期.为保证P. aeruginosa的初始状态相对稳定,实验首先把P. aeruginosa置于50mL培养基A中培养8h,使P. aeruginosa进入对数生长期且微生物特性相对稳定.实验分别向各孔加入2mL培养基A,然后再向每个孔投加10µl对数生长期的 P. aeruginosa菌液并按照相应实验浓度滴加C8-oxo-HSL储备液.24孔板完成菌液滴加及AHLs浓度调控后置于气浴摇床中37℃培养 12h.为了同步检测 P. aeruginosa在不同C8-oxo-HSL浓度作用下形成生物膜的变化,在实验开始时向每个孔中放置1根1.5cm长的PVC超滤膜(海南立升,中国),以观察 12h培养后超滤膜上生物膜形成情况,实验操作方法参考文献[5].为了避免混合液中离散 P. aeruginosa菌体对生物膜检测造成影响,生物膜检测前需用无菌水轻柔冲刷超滤膜表面生物膜直至无明显菌落掉落为止[5].本实验过程皆为无菌操作.

实验中,微生物量与EPS中蛋白质、多糖分别通过OD600、考马斯亮蓝法和苯酚/硫酸法进行检测[19].P. aeruginosa菌胶团情况通过Zeta电位(Zeta sizer Nano Z,英国马尔文)进行分析.本研究中对样品测试预处理参考文献[5].由于本研究使用培养基进行实验分析,培养基中含有大量蛋白质与多糖以及难以测定其中可溶性有机物与松散型 EPS.因此本研究通过离心方法获取 P. aeruginosa菌体,再对该菌体进行EPS分离并获得菌体紧密型EPS(TB-EPS).

以上所有实验均进行5次平行重复实验.

2 结果与讨论

2.1 C8-oxo-HSL对P. aeruginosa生长过程中菌量影响

本研究采用OD600作为分析P. aeruginosa菌量的指标.从图3可以看出,C8-oxo-HSL浓度为0和10-11g/L时,P. aeruginosa的OD600仅为1.3左右.当C8-oxo-HSL浓度为10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5和10-4g/L时,P. aeruginosa的OD600则维持在1.7左右. 从P. aeruginosa的菌量变化可以知道C8-oxo-HSL可以有效促进P. aeruginosa的生长以及增加其菌量.然而 P. aeruginosa主要由C12-oxo-HSL和C4-HSL两种信号分子控制其群体效应系统并参与其增殖过程[20].这一结果说明其他群体效应信号分子也能有效刺激 P. aeruginosa增长.这可能因为群体感应系统信号分子化学结构相似,当相似信号分子达到一定浓度也可通过群体效应系统激活相应行为[13-17].而且当 C8-oxo-HSL浓度达到 10-10g/L的时候,P. aeruginosa的菌量发生明显的跃升,而 C8-oxo-HSL浓度大于 10-10g/L 却不会再起引起 P. aeruginosa菌量跃升.这说明10-10g/L C8-oxo- HSL很可能是促进P. aeruginosa大量生长的阙值浓度.

图3 不同C8-oxo-HSL浓度作用下P. aeruginosa经12h培养后菌量变化Fig.3 Amount of the P. aeruginosa after 12h culture with C8-oxo-HSL addition

此外,群体效应不仅是对细菌自身的控制系统,也是与其他细菌交流的信息交换系统.从图 3则可以看出,当C8-oxo-HSL达到10-10g/L范围的时候,P. aeruginosa则可以互相影响进一步以群体形式大量增殖.然而不同细菌的相同行为也很可能具有不同的阙值浓度,所以目前的研究主要针对单一细菌进行研究[21-22].但由于在实际的污水处理系统当中,活性污泥中含有大量不同种类的细菌.本研究主要挑选了活性污泥当中最为常见的 P. aeruginosa作为研究对象来观察群体效应分子对活性污泥微生物的影响.从 P. aeruginosa在10-10g/L C8-oxo-HSL作用下细菌量增加可知活性污泥中具有LuxI/R群体效应系统的革兰氏阴性菌可在较低的 AHLs浓度作用下快速增长.

2.2 C8-oxo-HSL 对 P. aeruginosa生长中TB-EPS影响

图4 P. aeruginosa经12h培养后菌液紧密型EPS变化Fig.4 Variations of the P. aeruginosa EPS after 12h culture with C8-oxo-HSL addition

由图4(a),可以看到C8-oxo-HSL浓度为0、10-11、10-10、10-9、10-8g/L时,P. aeruginosa TB-EPS中蛋白质浓度约为140-145mg/L.当C8-oxo-HSL浓度达到 10-7、10-6、10-5和 10-4g/L 时,P. aeruginosa TB-EPS 中蛋白质浓度则高达160mg/L以上.因此,C8-oxo-HSL达到一定浓度时可有效促进 P. aeruginosa分泌大量蛋白质至TB-EPS当中.而且10-7g/L C8-oxo-HSL是促进P. aeruginosa大量分泌蛋白质的阙值浓度,该浓度与本课题组关于 P. aeruginosa生物膜的研究结果[5]相近.这主要因为生物膜是依靠细菌以及细菌分泌的胞外聚合物进行菌与菌的粘合而形成,其中胞外聚合物扮演着粘合剂的作用.因此生物膜与细菌的EPS有着紧密的联系,所以生物膜形成与细菌分泌 EPS在群体效应的阙值浓度十分相似.

图 4(b)显示了不同 C8-oxo-HSL浓度对 P. aeruginosa细菌 TB-EPS中多糖的影响.从图中可以看到0、10-11、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5和 10-4g/L C8-oxo-HSL 分别作用于 P. aeruginosa,但其TB-EPS中多糖浓度基本维持在310～320mg/L左右.P. aeruginosa TB-EPS中多糖浓度没有随着 C8-oxo-HSL浓度增加而发生明显变化,说明 C8-oxo-HSL对于 P. aeruginosa TB-EPS中多糖没有显著影响.这主要因为LuxI/R群体效应系统更多地在于控制细菌蛋白质的表达与释放.因此,从图 4可以看出 C8-oxo-HSL对于P. aeruginosa TB-EPS中蛋白质具有显著的影响,但是对于其中的多糖没有过多影响作用.

2.3 C8-oxo-HSL对P. aeruginosa菌胶团稳定性影响

菌胶团是微生物间按照一定排列顺序互相粘结在一起,并且被一个公共荚膜所包围形成一定形状的细菌胶团[23].菌胶团具有较强的吸附和氧化有机物能力,并为其中微生物提供良好的生存环境,是活性污泥和生物膜的重要组成部分,并在水处理过程中起重要作用.因此菌胶团是生物法处理污水技术中最主要的部分之一,是保持整个污水处理系统稳定运行的关键因素之一[23-25].菌胶团的Zeta电位可以用于表示菌胶团胶体系统的稳定性趋势.Zeta电位绝对值大则菌胶团间相对稳定,Zeta电位绝对值小则菌胶团间则容易失稳团聚.因此,本研究采用Zeta电位作为菌胶团稳定性指标.

图 5 显示了不同 C8-oxo-HSL浓度对 P. aeruginosa菌胶团Zeta电位影响.随着C8-oxo-HSL浓度不断升高,P. aeruginosa菌胶团胶体Zeta电位不断升高,由-16mV增长到-25mV,即C8-oxo-HSL浓度增加有利于使P. aeruginosa菌胶团胶体系统趋向于稳定状态而不易团聚.这主要因为随着C8-oxo-HSL浓度升高,P. aeruginosa细菌分泌大量的蛋白质(图4(a))而促进了菌胶团荚膜的形成和加强整个菌胶团的稳定性. C8-oxo-HSL浓度达10-10g/L,P. aeruginosa菌胶团胶体 Zeta电位有明显升高.这一结果说明10-10g/L C8-oxo-HSL 是 群 体 效 应 使 P. aeruginosa菌胶团胶体稳定性提高的阙值浓度.而该阙值浓度与2.1中影响P. aeruginosa细菌量的阙值浓度相同,说明C8-oxo-HSL通过促进P. aeruginosa菌量增加,使细菌不断团聚从而提高整个菌胶团来增强菌胶团的稳定性.因此, C8-oxo-HSL可有效地通过群体效应作用使污水处理系统中的菌胶团稳定性有明显增强.

图5 P. aeruginosa 12h培养后菌胶团稳定性变化Fig.5 Zoogloea stability of the P. aeruginosa after 12h culture with C8-oxo-HSL addition

2.4 C8-oxo-HSL对P. aeruginosa生物膜形成影响

本研究通过分析生物膜菌量来研究 C8-oxo-HSL对P. aeruginosa生物膜形成的影响(图6).C8-oxo-HSL浓度为0、10-11、10-10、10-9g/L时候,P. aeruginosa生物膜菌量约为 1.4OD600. C8-oxo-HSL浓度达到10-8g/L以上,P. aeruginosa生物膜细菌量则快速增长,预示生物膜快速形成.这一结果也验证了2.1中的结论,C8-oxo-HSL可以有效促进 P. aeruginosa的生长以及增加 P. aeruginosa的细菌量.从生物膜细菌量变化可以得出10-8g/L C8-oxo-HSL为P. aeruginosa生物膜快速增长的阙值浓度.然而 Filckinger等[26]指出P. aeruginosa的最适信号分子C12-oxo-HSL引起其生物膜快速增长的阙值浓度达10-2g/L.孙颉等[7]则指出 10-6g/L C8-oxo-HSL浓度方可引起养殖污水处理系统中生物膜明显快速增长.这主要是由于细菌菌体间个体差异性造成,不同细菌对应的相同行为阙值浓度具有较大差异[17-26].因此,对于利用AHLs信号分子刺激生物膜生长需进行预实验测量阙值浓度.

C8-oxo-HSL刺激P. aeruginosa生物膜快速生长的阙值浓度(10-8g/L)比引起混合液中 P. aeruginosa的细菌快速增长的阙值浓度(10-10g/L)要高.这主要因为生物膜的生长是细菌量增加、EPS析出以及细菌个体与EPS团聚和吸附的复杂过程.之前研究[26]指出需更高浓度的群体效应信号分子方可引起P. aeruginosa大量析出EPS并促使细菌体-EPS团聚物吸附在物体表面形成生物膜.因此,由于P. aeruginosa生物膜的形成同时和细菌菌量与胞外聚合物浓度直接相关,所以C8-oxo-HSL刺激P. aeruginosa生物膜快速生长的阙值浓度较高.

图6 不同C8-oxo-HSL浓度作用下P. aeruginosa经12h培养后生物膜变化Fig.6 Variations of the P. aeruginosa biofilm after 12h culture with C8-oxo-HSL addition

3 结论

3.1 C8-oxo-HSL可有效刺激P. aeruginosa大量生长,其对应阙值浓度为10-10g/L C8-oxo-HSL,并且推知具有LuxI/R群体效应系统的革兰氏阴性菌在较低的AHLs浓度作用下可大量增殖.

3.2 C8-oxo-HSL可有效刺激P. aeruginosa分泌大量蛋白质到 TB-EPS中,其对应阙值浓度为10-7g/L C8-oxo-HSL.但 C8-oxo-HSL 对 P. aeruginosa TB-EPS中的多糖没有明显影响作用.

3.3 C8-oxo-HSL可通过促进P. aeruginos菌量增加,使细菌不断团聚从而增强菌胶团的稳定性

3.4 C8-oxo-HSL可有效促进P. aeruginosa形成生物膜.但由于P. aeruginosa生物膜的形成同时和细菌菌量与胞外聚合物浓度直接相关,所以C8-oxo-HSL刺激P. aeruginosa生物膜快速生长的阙值浓度较高.

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Effect of C8-oxo-HSL on the growth of P. aeruginosa in wastewater treatment.

ZHOU Li-jie1,2,3, WANG Xin3, HAN Qian1, ZHU Ting-ting1, CHENG Gong1, XIA Si-qing3*(1.State Environmental Protection Key Laboratory of Drinking Water Source Management and Technology, Shenzhen Key Laboratory of Drinking Water Source Safety Control, Shenzhen Key Laboratory of Emerging Contaminants Detection & Control in Water Environment, Shenzhen Academy of Environmental Sciences, Shenzhen 518001, China；2.College of Chemistry and Emvironmental Engineering, Shenzhen University, Shonzhen 518060, China；3.State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China). China Environmental Science, 2017,37(5)：1930～1936

N-(3-oxo octanoyl)-L-homoserine lactone (C8-oxo-HSL) is a commonly detected quorum sensing molecule in both natural and built environments. Although it is known that Pseudomonas aeruginosa CICC 23618 can secrete C8-oxo-HSL, behavioral changes of P. aeruginosa under the influence of C8-oxo-HSL remain unelucidated. Due to unique bioactivities often harbored by P. aeruginosa species important to many biological processes (e.g., activated sludge process), it is fundamentally important to understand effects of C8-oxo-HSL to P. aeruginosa. The study showed that C8-oxo-HSL at as low as 10-10g/L level could enhance the growth rate of P. aeruginosa. Thus, it is rational to predict that the growth of gram-negative bacteria bearing the LuxI/R quorum sensing system might also be enhanced by HSL molecules at low concentrations. The study also observed that 10-7g/L C8-oxo-HSL was sufficient to cause P. aeruginosa to secrete a relatively high amount of proteins into its tightly bound EPS, but the production of polysaccharide unaffected by C8-oxo-HSL. Biofilm formation is a complex biological process involving combined effects of cell growth and EPS production. Given the effects mentioned above, it is not surprised to see that 10-8g/L C8-oxo-HSL eventually enhanced the formation of P. aeruginosa biofilm and improved the stability of its cell aggregates. Overall, the study quantitatively demonstrated how C8-oxo-HSL as a representative of HSL quorum sensing family impacted the physiology of P. aeruginosa and revealed its potential implications in biological processes.

quorum sensing；P. aeruginosa；C8-oxo-HSL；zoogloea；biofilm

X171

A

1000-6923(2017)05-1930-07

周礼杰(1987-),男,广东深圳人,工程师,博士,主要从事水污染控制及资源化研究.发表论文10余篇.

2016-10-28

国家自然科学基金(51378368);深圳市科技研发资金项目(CXZZ20150330151321966)

* 责任作者, 教授, siqingxia@tongji.edu.cn