头穴丛刺联合康复疗法对局灶性脑梗死大鼠神经功能缺损及缺血侧皮层VEGF蛋白表达的影响

唐强,阮野,叶涛,朱路文,吴孝军,李宏玉,田源



头穴丛刺联合康复疗法对局灶性脑梗死大鼠神经功能缺损及缺血侧皮层VEGF蛋白表达的影响

唐强1,阮野2,叶涛2,朱路文1,吴孝军2,李宏玉2,田源2

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院,哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学,哈尔滨 150001)

目的 观察针康法对局灶性脑梗死大鼠神经功能缺损情况及缺血侧大脑皮层血管内皮生长因子蛋白表达的影响,探讨针康法促进大鼠受损功能恢复的作用机制。方法 选取健康雄性SD大鼠90只,随机分为模型组、针刺组、康复组、针康组、假手术组5组,每组又分为3 d、7 d、14 d 3个亚组,每个亚组6只。采用改良的Zea-Longa线栓法制备右侧大脑中动脉永久性梗死(MCAO)模型。针刺组大鼠行模拟头穴丛刺法治疗;康复组行跑台训练;针康组行头穴丛刺结合跑台训练;模型组及假手术组不予以任何治疗。采用改良的神经功能缺损评分(mNSS)评定大鼠神经功能缺损情况,并采用Western blot法测定缺血侧大脑皮层VEGF蛋白表达量。结果 假手术组大鼠未见神经功能缺损。与模型组相比,针刺组、康复组及针康组治疗3 d后mNSSs比较,差异均无统计学意义(＞0.05);治疗7 d、14 d后,针刺组、康复组及针康组mNSSs评分比较,差异均有统计学意义(＜0.05)。治疗7 d、14 d后,针康组的mNSS评分均低于针刺组和康复组(＜0.05);针刺组和康复组mNSS评分比较,差异无统计学意义(＞0.05)。治疗3 d后,各治疗组大鼠VEGF蛋白表达量与模型组大鼠比较差异均无统计学意义 (＞0.05),7 d、14 d各治疗组大鼠VEGF蛋白表达量较模型组大鼠明显增多(＜0.05)。治疗7 d、14 d后,针康组VEGF表达量与针刺组、康复组比较,差异具有统计学意义(＜0.05);康复组与针刺组大鼠各时间点VEGF表达量比较,差异无统计学意义(＞0.05)。结论 头穴丛刺法与康复训练均能够改善局灶性脑梗死大鼠受损的神经功能,并能够提高大鼠缺血大脑皮层中VEGF蛋白表达量,且针康法联合治疗能够取得更好的效果;其机制可能与VEGF的高表达能够更好地促进脑缺血区域血管的重塑与再生相关。

针刺疗法;穴,百会;丛刺;康复训练;改良神经功能缺损评分;血管内皮生长因子;脑梗死

脑卒中归属于中医学“中风病”的范畴,又分为缺血性卒中和出血性卒中两大类,其中缺血性卒中又称脑梗死,是临床中神经系统方面的常见病、高发病,已经成为现今人类三大致死疾病之一,并具有极高的致残率,存活者多遗留有不同程度的运动功能障碍、语言障碍、智力障碍等神经功能缺损情况,给家庭和社会造成了沉重的负担。头穴丛刺疗法自上世纪70年代创立以来发展飞速,至今经过多方研究证实已得到国内外的普遍认可,是临床治疗脑卒中的常用针刺方法;而现代康复治疗技术,以解剖学、运动学、生物力学等理论为基础,涵盖物理治疗、作业治疗、言语治疗等多方面训练方法,能够最大限度地恢复患者丧失的运动及神经功能,为患者更好地回归家庭与社会起到了至关重要的作用。近些年,将头穴丛刺与康复训练相结合已成为临床针对脑梗死疾病的重要治疗手段。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是作用于血管内皮细胞的生长因子,其作用在于促进血管内皮增生、增强血管通透性和加速新生血管形成3个方面,对缺血损伤后的大脑起着至关重要的保护作用[1-3]。

本实验采用改良的Zea-Longa线栓法制备永久性大脑中动脉梗死(MCAO)模型,应用改良神经功能缺损评分(modified Neurological Severity Score, mNSS)评定大鼠各时间点神经功能恢复情况,并采用Western blot技术测定各组大鼠VEGF蛋白的表达,探讨针康法促进脑梗死大鼠损伤功能恢复的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

成年清洁级雄性SD大鼠90只,体重(250±30)g,由黑龙江中医药大学动物饲养中心提供[合格证号SYXK(黑)2010007],随机分为模型组、针刺组、康复组、针康组、假手术组5组,每组又分为3 d、7 d、14 d 3个亚组,每个亚组6只。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂

牛血清白蛋白(BSA)、蛋白酶抑制剂(BZM、PMSF和PEP)、吐温-20、过硫酸铵、b-巯基乙醇(2-ME)、十二烷基硫酸钠(SDS)、聚丙烯酰胺、TEMED、Tris、Glycine、PVDF、杂交膜、预染蛋白Marker (10-180kDa)、VEGF抗体、ACTIN抗体、二抗。

1.2.2 主要仪器

PB-10型PH计(Sartorius公司),PAC1000型电泳仪(Bio-RAD公司),AL204电子天平(Mettler-Toledo公司),转膜槽(Bio-RAD公司),超低温冰箱(青岛海尔股份有限公司),超低温高速离心机(江苏南京温诺仪器设备有限公司),微量移液器(上海佳安分析仪器厂),华佗牌一次性针灸针(苏州医疗用品厂有限公司)。

1.3 动物模型制备

除假手术组外,其余各组均参照Zea-Longa线栓法[4]进行改良,经颈总动脉进线制备右侧MCAO模型。大鼠苏醒后,以出现右侧Horner征,提尾测试躯干左侧卷曲,爬行时向患侧转圈为造模成功并可入组标准。假手术组同等条件抓取下造模方法同上,但仅分离暴露颈动脉,不对大脑中动脉进行梗死。

1.4 处理方法

针刺组大鼠于造模成功24 h后,参照大鼠穴位图谱[5],取大鼠百会穴及左右旁开2 mm,共3点,75%乙醇消毒后采用0.25 mm×13 mm毫针向鼻尖方向平刺入帽状腱膜下5 mm,以模拟头穴丛刺针法,每次捻转2 min,速度200转左右/min,留针30 min。每日1次。

康复组行跑台训练,每次30 min,坡度0°,速度15 m/min。每日1次。

针康组行头穴丛刺后将大鼠带针置于跑台上进行训练,针刺及训练方法同针刺组和康复组。每日1次。

模型组与假手术组不予以任何治疗。

1.5 改良神经功能缺损评分(neurological severi- ty scores, NSS)

参考经典NSS神经功能缺损评分法[6]进行改进,更改为14分评分表。

1.6 样本取材处理

各组大鼠在各时间点严格按照无菌要求,深度麻醉后快速取脑,分离右侧大脑皮层,置于液氮中保存。

1.7 Western blot测定VEGF蛋白的表达水平

从液氮中取出脑组织放入预冷研钵充分短时研磨,加入蛋白裂解液至研钵冲洗研磨好的组织,充分混匀后将悬液放入EP管中,使用前加蛋白酶抑制剂。将悬液放在冰上冰浴20 min,确保裂解充分,离心20 min后收集上清。采用BCA蛋白定量试剂盒定量检测各标本总蛋白。

将测定好浓度的细胞裂解液与4×sample buffer混匀,置于100℃沸水中5 min,低速离心3～5 s,室温冷却,将蛋白marker和样品依次加到凝胶的上样孔中,空余的上样孔用1×sample buffer补齐。进行SDS- PAGE电泳。预先将PVDF膜在甲醇中浸泡5～10 min,使之激活,采用湿法将凝胶转移至电转夹中,使胶位于阴极,PVDF膜位于阳极,紧密固定之后置于电专槽中,注入transfer buffer,在冰上以200 mA转膜2 h。将转有蛋白的PVDF膜放入杂交袋中,再加入3%的BSA- TBST封闭液,置于翻转仪上平缓翻转,封闭2 h。将PVDF膜与抗体稀释液置于杂交袋中孵育过夜。用TBST对PVDF膜进行洗涤。将辣根过氧化物酶标记的二抗用3%的BSA-TBST封闭液稀释,与PVDF膜置于杂交袋中,孵育1.5 h。用TBST对PVDF膜进行洗涤。按照ECL增强发光液试剂盒的说明书配制曝光液,向PVDF膜上滴加显色曝光。结果采用Quantity One图像分析软件进行定量分析。

1.8 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用-检验。以＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠各时间点VEGF蛋白阳性表达量比较

治疗3 d后,各治疗组大鼠VEGF蛋白表达量与模型组大鼠比较未见显著差异(＞0.05),7 d、14 d各治疗组大鼠VEGF蛋白表达量较模型组大鼠明显增多(＜0.05)。治疗7 d、14 d后,针康组VEGF表达量与针刺组、康复组比较,差异具有统计学意义(＜0.05);康复组与针刺组大鼠VEGF表达量比较,差异无统计学意义(＞0.05)。详见图1、2,表1。

假手术组 模型组 康复组 针刺组 针康组 VEGF 3 dACTIN VEGF 7 dACTIN VEGF 14 dACTIN

图2 各组大鼠VEGF表达灰度值分析

表1 各时间点各组大鼠VEGF表达灰度值分析

注 :与假手术组比较1)＜0.05;与模型组比较2)＜0.05;与针刺组比较3)＜0.05;与康复组比较4)＜0.05

2.2 各组大鼠各时间点mNSS比较

假手术组无神经功能缺损发生。治疗3 d后,各治疗组mNSSs与模型组大鼠比较,差异均无统计学意义(＞0.05);治疗7 d、14 d后各治疗组mNSSs与模型组大鼠比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。治疗7 d、14 d后,针康组mNSS均显著低于康复组与针刺组(＜0.05);康复组与针刺组大鼠mNSS比较,差异无统计学意义(＞0.05)。详见表2。

表2 各时间点各组大鼠mNSS比较 (±s,分)

表2 各时间点各组大鼠mNSS比较 (±s,分)

组别n3 d7 d14 d 假手术组6000 模型组68.85±1.181)7.41±0.951)5.23±1.121) 针刺组68.71±1.211)6.37±1.051)2)4.15±1.071)2) 康复组68.69±1.081)6.35±1.071)2)4.11±1.011)2) 针康组68.65±1.171)5.13±1.271)2)3)4)2.27±1.051)2)3)4)

注 :与假手术组比较1)＜0.05;与模型组比较2)＜0.05;与针刺组比较3)＜0.05;与康复组比较4)＜0.05

3 讨论

神经行为学评定是现代动物实验针对神经功能改变情况的直接记录手段,是观察脑梗死大鼠神经功能缺损与恢复水平的一项重要指标[7-8]。既往研究中,Seo HG等[9]曾对脑梗死大鼠采用抓握实验和前肢放置实验进行评定,以观察大鼠平衡协调能力的改善。Du Y等[10]也曾在电针治疗脑梗死大鼠的实验中,采用神经行为学评分评定大鼠神经功能的损伤情况,并得出结论,其治疗机制可能与电针有加速缺血区血管再生的作用, 利用头穴丛刺及康复训练对脑梗死大鼠进行干预,亦是对神经功能损伤进行的研究。与模型组相比,治疗 7 d、14 d后,针刺组、康复组及针康组mNSSs评分均降低(＜0.05),表明头穴丛刺疗法、康复训练均可改善脑梗死大鼠受损的神经功能。针康法作为二者的联合治疗手段,该组大鼠治疗7 d、14 d后mNSS降低,较单一治疗组更明显(＜0.05),表明针康法能够更好地改善缺血造成的神经功能损伤。治疗7 d、14 d后康复组mNSS与针刺组比较,无显著性差异(＞0.05),表明对于神经功能损伤的改善两者并无明显差异。

既往国内外已有大量文献报道过VEGF与缺血性脑损伤的密切相关性[11-15]。它直接作用于血管内皮细胞,是一种特异性很强的多功能因子,在缺血性脑损伤发生过程中能够发挥调控血管内皮细胞的增殖分化、新生血管形成和血管的通透性的作用[16]。由于中枢神经元对缺氧刺激非常敏感,当脑梗死发生后,缺氧环境就成为一种特异的激活信号,诱导VEGF应激性表达增高,发挥相应作用,提高脑组织缺血区的灌注及供氧,尽可能控制脑损伤发展[17]。对局灶性脑梗死动物的VEGF变化亦早有大量研究,观察到梗死后7 d VEGF高表达,同时血管增生活跃,证实了VEGF作为血管修复因子与脑缺血环境的相关性及其重要的脑血管保护意义[18-20]。而临床对脑梗死患者血清VEGF变化规律的研究也证实,患者缺血发作后血清中VEGF呈动态增高表达,初期脑血流量减少时VEGF表达迅速上调,7 d内上升趋势明显,而随着脑血供改善其表达也逐渐减少, 7～14 d放缓,14 d后开始有回落趋势,从而证实了VEGF在缺血发生后的脑组织血流灌注中发挥了重要作用[21-26]。在本实验中,治疗7 d、14 d后局灶性脑梗死模型组大鼠VEGF表达水平较假手术组大鼠明显增加(＜0.05),提示VEGF通过生成血管提高了缺血侧脑组织的血液灌注,与既往研究相符。经头穴丛刺疗法、康复训练治疗7 d、14 d后,VEGF表达较模型组增多(＜0.05),康复组与电针组比较,差异无显著性(＞0.05),与mNSS结果相一致,表明头穴丛刺与康复训练对缺血性脑损伤均具有一定的脑血管修复作用,且神经功能缺损的改善与VEGF表达增多相关。治疗7 d、14 d后,各组大鼠中针康组VEGF表达量最多 (＜0.05),提示头穴丛刺联合康复训练能够令缺血侧血管得到更好的修复, mNSS也表明该组大鼠受损神经功能恢复得最好,强调了这一结论。

本研究表明,针康法对局灶性脑梗死大鼠受损神经功能的改善明显优于头穴丛刺或康复训练的单一治疗,这一结论与其能够更好地促进缺血侧脑组织VEGF的表达密切相关,同时也强调了这种相关性是其治疗缺血性卒中的重要机制之一。本研究为探讨针康法促进脑梗死发作后神经功能缺损改善提供了新的研究方向,证实了联合治疗优势的可靠性,为其更加广泛地应用于临床提供了新的理论支持。但同时,本研究尚存在不足之处,治疗介入的最优时间、检测时间点的密度等都有待于进一步研究。

[1] Wu L, Jiang Y, Zhu J,. Orosomucoid1: Involved in vascular endothelial growth factor-induced blood-brain barrier leakage after ischemic stroke in mouse[J]., 2014,109(10):88-98.

[2] Ma Y, Qu Y, Fei Z. Vascular endothelial growth factor in cerebral ischemia[J]., 2011,89(7):969- 978.

[3] Kajdaniuk D, Marek B, Borgiel-Marek H,. Vascular endothelial growth factor (VEGF) - part 1: in physiology and pathophysiology[J]., 2011,62(5):444-455.

[4] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S,. Reversi- ble middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]., 1989,20(1):84-91.

[5] 华兴邦,李辞蓉,周浩良,等.大鼠穴位图谱的研制[J].实验动物与动物实验,1991,5(1):1-5.

[6] Chen J, Li Y, Wang L,. Therapeutic benefit of intra- venous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats[J]., 2001,32 (4):1005 -1011.

[7] 王辉,王蓉,何娅,陈松盛.大鼠脑梗死模型神经行为学评价的可靠性探讨[J].陕西医学杂志,2015,44(6): 649-651.

[8] 钟艺华,唐显军,李光勤,等.不同穴组电针对局灶性脑梗死大鼠神经行为学及Neurocan表达的影响[J].中国康复理论与实践,2013,19(5):444-447.

[9] Seo HG, Kim DY, Park HW,. Early motor balance and coordination training increased synaptophysin in subcortical regions of the ischemic rat brain[J]., 2010,25(11):1638-1645.

[10] Du Y, Shi L, Li J,. Angiogenesis and improved cerebral blood flow in the ischemic boundary area were detected after electroacupuncture treatment to rats with ischemic stroke[J]., 2011,33 (1):101-107.

[11] 王军,尚凤伟,朱登纳,等.银杏内酯B对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织Caspase-3及VEGF mRNA表达的影响[J].郑州大学学报(医学版),2013,48(2):175-178.

[12] 孙桂莲,杨志亮.新生大鼠缺氧缺血性脑损伤时脑细胞VEGF的表达与凋亡的关系[J].中国医科大学学报,2011,40(6):524-527.

[13] 方邦江,周爽,陈浩,等.复元醒脑汤对糖尿病合并缺血性脑损伤大鼠VEGF蛋白的影响[J].上海中医药杂志,2010,44(5):12-15.

[14] 王卫东,王琳,邓丽影,等.内源性VEGF表达对缺血性脑损伤后成年大鼠海马齿状回神经发生影响的实验研究[J].中风与神经疾病杂志,2009,26(4):388-391.

[15] 张珊珊,郑湘榕,杨于嘉,等.腺病毒介导VEGF165基因转移对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用[J].中国当代儿科杂志,2008,10(6):737-742.

[16] 赵丽静,刘亢丁.血管内皮细胞生长因子治疗缺血性脑卒中的新思路[J].中华临床医师杂志(电子版),2011, 5(7):2022-2025.

[17] Sun Y, Jin K, Xie L,. VEGF-induced neuropro- tection, neurogenesis, and angiogenesis after focal cerebral ischemia[J]., 2003,111(12):1843-1851.

[18] Wang YQ, Guo X, Qiu MH,. VEGF over-expression enhances striatal neurogenesis in brain of adult rat after a transient middle cerebral artery occlusion[J]., 2007,85(1):73-82.

[19] Ma Y, Zechariah A, Qu Y,. Effects of vascular endothelial growth factor in ischemic stroke[J]., 2012,90(10):1873-1882.

[20] Fujiki M, Abe E, Nagai Y, et al. Electroconvulsive seizure-induced VEGF is correlated with neuroprotective effects against cerebral infarction: Involvement of the phosphatidylinositol-3 kinase/Akt pathway[J]. Exp Neurol, 2010, 225(2):377-383

[21] Stowe AM, Plautz EJ, Eisner-Janowicz I,. VEGF protein associates to neurons in remote regions following cortical infarct[J]., 2007,27 (1):76-85.

[22] 金岗生,冯炯,陈衍,等.急性脑梗死患者VEGF浓度变化与NIHSS评分的关系[J].中国现代医生,2016,54 (19):17-20.

[23] 王翠兰,石秋艳,孙原,等.急性脑梗死患者血清VEGF与bFGF水平的动态变化[J].中风与神经疾病杂志,2014,31(4):292-294.

[24] 史福平,王惠凌,邸卫英,等.急性脑梗死患者MMP-9和VEGF的动态变化及其意义[J].临床医学,2014,34 (1):3-5.

[25] 陈生,胡志涛.VEGF与急性脑梗死的关系[J].安徽医药,2011,15(5):606-607.

[26] 何建明,李玉蓉,韦英秀,等.急性脑梗死患者治疗前后VEGF水平动态变化的研究[J].世界中西医结合杂志,2010,5(9):762-764.

Effect of Acupuncture plus Rehabilitation on Neurologic Deficit and VEGF Protein Expression in Cortex on the Infarction Side in Rats with Focal Cerebral Infarction

1,2,2,-1,-2,-2,2.

1.,150040,; 2.,150001,

Objective To observe the effect of acupuncture plus rehabilitation on neurologic deficit and the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) protein in cortex on the infarction side in rats with focal cerebral infarction, and to explore the action mechanism of acupuncture plus rehabilitation in promoting the recovery of impaired function in rats. Method Ninety healthy male Sprague-Dawley (SD) rats were randomized into a model group, an acupuncture group, a rehabilitation group, an acupuncture-rehabilitation group, and a sham operation group, and the five groups were further divided into three subgroups, i.e. 3 d, 7 d, and 14 d subgroups, 6 rats in each subgroup. The modified Zea-Longa method was adopted to prepare the model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) on the right side. Rats in the acupuncture group received simulant scalp-points cluster needling; the rehabilitation group was intervened by treadmill exercise; the acupuncture-rehabilitation group was intervened by scalp-points cluster needling plus treadmill exercise; the model group and sham operation group didn’t receive any interventions. The modified Neurological Severity Score (mNSS) was adopted to evaluate the rat’s neurologic deficit, and Western blotting was used to detect the expression of VEGF protein in cortex on the infarction side. Result Neurologic deficit wasn’t found in rats in the sham operation group. After 3-day treatment, the mNSSs in the acupuncture group, rehabilitation group, and acupuncture-rehabilitation group were insignificantly different from the score in the model group (＞0.05), while the differences were statistically significant respectively after 7-day and 14-day treatment (＜0.05). Respectively after 7-day and 14-day treatment, the mNSS of the acupuncture-rehabilitation group was significantly lower than that in the acupuncture group and rehabilitation group (＜0.05); there was no significant difference in comparing the mNSS between the acupuncture group and rehabilitation group (＞0.05). After 3-day treatment, the expression of VEGF protein in each treatment group was insignificantly different from that in the model group (＞0.05), while the expression of VEGF protein in each treatment group was significantly higher than that in the model group respectively after 7-day and 14-day treatment (＜0.05). Respectively after 7-day and 14-day treatment, the expression of VEGF in the acupuncture-rehabilitation group was significantly different from that in the acupuncture group and rehabilitation group (＜0.05); there were no significant differences in comparing the expression of VEGF at each time point between the rehabilitation group and acupuncture group (＞0.05). Conclusion Scalp-points cluster needling and rehabilitation both can improve the neurologic function in rat models of focal cerebral infarction, and enhance the expression of VEGF protein in infarction cortex, and the integration of acupuncture and rehabilitation can achieve a better result; the action mechanism is possibly related to the high expression of VEGF which can better promote the reconstruction and regeneration of the vessels in cerebral infarction area.

Acupuncture therapy; Point, baihui (GV20); Cluster needling; Rehabilitation; Modified Neurological Severity Score; Vascular endothelial growth factor; Cerebral infarction

1005-0957(2017)05-0602-06

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.05.0602

国家自然科学基金项目(81273818,81473762);黑龙江中医药大学领军人才计划(2012RCL02)

唐强(1963—),男,教授,博士,Email:tangqiang1963@163.com

2016-10-28