四君子合小柴胡汤对移植性原发性肝癌抑瘤作用的实验研究

2017-05-22罗昌国张晶李阳

中国医药科学 2017年6期

罗昌国+张晶+李阳

[摘要] 目的觀察四君子合小柴胡汤对移植性原发性肝癌小鼠肿瘤生长的影响。方法 100只肝郁脾虚型移植性原发性肝癌小鼠随机分为模型组、5-FU 组、四君子汤组（简称四君组）、小柴胡汤组（简称柴胡组）、四君子合小柴胡汤组（简称君柴组），每组20只。模型组、四君组、柴胡组、君柴组小鼠分别给予蒸馏水、四君子汤、小柴胡汤、四君子合小柴胡汤灌胃，每天1次，连续给药10d；5-FU 组隔天1次给予 5-FU注射液腹腔注射，给药5次。观察各组小鼠的体质量、瘤重、肿瘤细胞凋亡、细胞周期。结果小鼠体质量比较，各组显著高于模型组（P<0.05），君柴组高于5-Fu组（P<0.05）。比较小鼠去瘤体质量，各组显著高于模型组（P<0.05），君柴组高于5-Fu组（P<0.05）。比较肿瘤瘤重和抑瘤指数，5-Fu组、君柴组显著低于模型组、四君组和柴胡组，差异有统计学意义（P<0.05）。比较抑瘤率，5-FU 组、君柴组显著高于四君组和柴胡组（P<0.05）。细胞凋亡比较，君柴组高于四君组、柴胡组（P<0.05），显著高于模型组（P<0.01）。比较肿瘤细胞凋亡，其余4组均显著高于模型组（P<0.05），君柴组显著高于四君组和柴胡组（P<0.05）；细胞周期所占百分比比较，5-Fu组、君柴组G0-G1期细胞显著高于模型组（P<0.05）；S期细胞百分比，5-Fu组、君柴组G0-G1期细胞显著低于模型组、四君组和柴胡组（P<0.05），G2-M 期各组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论四君子合小柴胡汤对肝郁脾虚型移植性原发性肝癌小鼠有抑瘤作用，比四君子汤、小柴胡汤单独应用好，其作用机制主要是诱导肝癌细胞凋亡。

[关键词] 四君子汤；小柴胡汤；原发性肝癌；动物实验

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）06-19-04

[Abstract] Objective To observe the effect of Sijunzi decoction combined with Minor Bupleurum decoction on tumor growth of mice with transplanted primary liver cancer. Methods 100 mice of hepatic stagnation and spleen deficiency type with transplanted primary liver cancer were randomly divided into the model group， 5-FU group， Sijunzi decoction group （abbreviated as Sijun group）， Minor Bupleurum decoction group （abbreviated as bupleurum group） and the Sijunzi combined with Minor Bupleurum decoction group （abbreviated as Jun bupleurum group）， with 20 in each. Mice in the model group， Sijun group， bupleurum group and Jun bupleurum group were respectively given gastric perfusion of distilled water， Sijunzi decoction， Minor Bupleurum decoction and Sijunzi decoction combined with Minor Bupleurum decoction for once every day with successive administration for 10 days. 5-FU group was given 5-FU injection by intraperitoneal injection for 5 times for once every two days. Body mass， tumor weight， tumor cell apoptosis and cell cycle of mice in every group were observed. Results Body mass of mice of every group was significantly higher than that of the model group （P<0.05）. Body mass of mice of the Jun bupleurum group was higher than that of the 5-Fu group （P<0.05）. By comparing body mass without tumor weight， that of every group was significantly higher than that of the model group （P<0.05）. Jun bupleurum group was higher than that of the 5-Fu group （P<0.05）. Tumor weight and anti-tumor indexes of the 5-Fu group and Jun bupleurum group were significantly lower than those of the model group， Sijun group and bupleurum group. Differences had statistical significance （P<0.05）. Anti-tumor rates of the 5-Fu group and Jun bupleurum group were significantly lower than those of Sijun group and bupleurum group （P<0.05）. Cell apoptosis of Jun bupleurum group was higher than that of the Sijun group and bupleurum group （P<0.05） and significantly higher than that of the model group （P<0.01）. Tumor cell apoptosis of other four groups was significantly higher than that of the model group （P<0.05）. Tumor cell apoptosis of Jun bupleurum group was significantly higher than that of Sijun group and bupleurum group （P<0.05）. By comparing percentage of cell cycle， G0-G1 stage cells of 5-FU group and Jun bupleurum group were significantly higher than that of the model group （P<0.05）. Percentage of S stage cell， G0-G1 stage cell of 5-FU group and Jun bupleurum group was significantly lower than that of the model group， Sijun group and bupleurum group （P<0.05）. Comparing G2-M stage cells， there were no statistical difference （P>0.05）. Conclusion Sijunzi decoction combined with Minor Bupleurum decoction has anti-tumor effect on mice of hepatic stagnation and spleen deficiency type with transplanted primary liver cancer and it has a better effect than single application of Sijunzi decoction and Minor Bupleurum decoction. The action mechanism is mainly to induce apoptosis of hepatoma cells.

[Key words] Sijunzi decoction； Minor Bupleurum decoction； Primary liver cancer； Animal experiment

原发性肝癌（HCC）是我国常见恶性肿瘤，每年新发肝癌和死于肝癌的患者居全球首位。中医药是我国治疗肝癌的重要方法，通过多年临床实践和研究，中医肝癌诊治已有一些初步共识。肝郁脾虚被认为是原发性肝癌中医证型之一[1]，疏肝健脾法被认为可以用于治疗肝癌，大量临床和实验研究表明四君子汤和小柴胡汤对原发性肝癌有一定的抑瘤和抗转移作用，体外试验表明，四君子汤可通过激活外周血单核细胞发挥抗肿瘤作用[2-3]，小柴胡汤能够抑制癌细胞生长，并诱导肿瘤细胞凋亡[4-5]，四君子汤可健脾，小柴胡汤能疏肝，两方均对原发性肝癌有一定治疗作用，但根据中医理论，两方联合使用才能完整体现“疏肝健脾”的治疗内涵，但两方联合使用的研究尚不多见。本研究采用肝癌动物模型，研究四君子汤联合小柴胡汤（下称四君子合小柴胡汤）对肝癌的抑瘤作用，并对比两方单独使用，观察其疗效是否更好。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物昆明种小鼠100只，雌雄各半，体质量（20±2）g，由深圳市疾病预防控制中心提供，购自南京君科生物工程有限公司，SPF 级条件下饲养，动物合格证号：SCXK（苏）2016-0056。

1.1.2 药物 5-氟尿嘧啶注射液（5-FU，南通精华制药有限公司，批号：FA161004）：生物安全柜中操作，以无菌生理盐水稀释至2mg/ mL后EP管分装，冰箱冷藏保存。四君子合小柴胡汤：人参10g，白术15g，茯苓15g，甘草6g，柴胡25g，生半夏10g，黄芩10g，生姜10g，大枣10g。四君子汤：人参10g，白术15g，茯苓15g，甘草5g。小柴胡汤：人参10g，柴胡25g，生半夏10g，黄芩10g，生姜10g，大枣10g，甘草6g。中药生药由康美药业提供，水煎后蒸馏提取至含生药2mg/mL的水煎液，冰箱冷藏保存备用。

1.1.3 瘤株、试剂及仪器设备肝癌H22腹水细胞，购于中国科学院深圳先进分院；RPMI-1640培养液购自北京索莱宝科技有限公司；小牛血清（FBS）购自浙江天杭生物科技股份有限公司，流式细胞仪（FC 500 MCL/MPL，美国贝克曼库尔特公司），酶标仪（美国BioTek公司），生物安全柜（苏州净化设备公司）。

1.2 方法

1.2.1 病证模型肝癌肝郁脾虚模型：造模分2个步骤，第1步，进行肝郁脾虚型造模，采用束缚加饮食失节法；第2步，肝郁脾虚型造模后第6天进行肝癌造模，第10天完成病证模型造模。肝郁脾虚型造模方法：采用束缚加饮食失节法，每晚将小鼠装入特制透气塑料小管中，并固定四肢和尾部限制活动，使其不能前进、后退及转身，束缚同时限制饮食，8h/d，共10d。肝癌模型造模方法：复苏冻存的腹水型肝癌 H22 细胞株，体外培养传代至对数生长期，离心，PBS 缓冲液冲洗后，生理盐水4倍稀释，充分混匀，于每只小鼠右前肢腋窝下皮下注射0.2mL。

1.2.2 分组及给药造模后24h，将100只小鼠随机分为5组，每组20只，分别是模型组、小柴胡汤组（柴胡组），四君子汤组（四君组）、四君子合小柴胡汤组（君柴组）、5-Fu组。按组别分笼饲养，常规饮食。接种后第5天开始给药，柴胡组、四君组、君柴组、模型组4组小鼠按常规剂量分别予小柴胡汤、四君子汤、四君子合小柴胡汤、蒸馏水灌胃，1 次/d，连续给药10d；5-FU 组按照 0.1mg/10kg体重隔天1次给予 5-FU 腹腔注射，连续给药10d。

1.2.3 观测指标

1.2.3.1 荷瘤小鼠体质量和去瘤体质量荷瘤小鼠体质量在每日给药前测定。去瘤体质量（g） = 处死前小鼠体质量（g）-解剖获得的肿瘤实际重量（g）。

1.2.3.2 肿瘤瘤重、肿瘤指数及肿瘤生长抑制率（抑瘤率）各组解剖所得肿瘤称重，即得肿瘤瘤重。肿瘤指数=肿瘤重量（g）/小鼠去瘤体重（g）。抑瘤率（%）=[1-实验组瘤重（g）/模型组瘤重（g）]×100%。

1.2.3.3 肿瘤细胞凋亡指数检测将新鲜肿瘤组织1.0g左右，按常规方法制备成细胞悬液并洗涤离心106个单细胞，采用流式细胞仪检测细胞凋亡百分比，观察细胞周期。

1.3 统计学方法

所有数据应用SPSS13.0软件进行统计学处理。所有资料以（）表示，多组间比较现采用方差分析进行显著性检验，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠体质量及去瘤体质量比较

各组显著高于模型组（P<0.05），君柴组高于5-Fu组（P<0.05）。比较小鼠去瘤体质量，各组显著高于模型组（P<0.05），君柴组高于5-Fu组（P<0.05）。见表1。

2.2 各組小鼠肿瘤瘤重、肿瘤指数及抑瘤率比较

君柴组、5-Fu组肿瘤瘤重及肿瘤指数显著低于其他三组，差异有统计学意义（P<0.05）。比较抑瘤率，5-FU 组、君柴组显著高于四君组和柴胡组（P<0.05）。见表2。

2.3 各组小鼠肿瘤细胞凋亡指数比较

比较肿瘤细胞凋亡，其余4组均显著高于模型组（P<0.05），君柴组显著高于四君组和柴胡组（P<0.05）；细胞周期所占百分比比较，5-Fu组、君柴组G0-G1期细胞显著高于模型组（P<0.05）；S期细胞百分比，5-Fu组、君柴组G0-G1期细胞显著低于模型组、四君组和柴胡组（P<0.05）。见表3。

3 讨论

3.1 肝癌病机

中医学认为，原发性肝癌属“肝积”“癥瘕积聚”“臌胀”“黄疸”等范畴，肝癌多因情志抑郁，脏腑失调，气机郁滞，湿困中焦，久则脾虚食少，湿郁化热，熏蒸肝胆，气滞血瘀久而成肝积，其中以肝郁脾虚型多见[6-7]，中医学认为，肝脾两脏关系密切，脾必得肝木的条达活泼、升散疏泄之性，才能升降如常；肝气亦需脾气的滋养。肝为刚脏，必赖脾气之柔润濡养，方能不致刚强太甚而遂其条达之性。四君子汤出于《太平惠民和剂局方》，小柴胡汤出自《伤寒论》，均是中医经典名方，四君子汤可以健脾益气，小柴胡汤可以疏肝理气。四君子汤治疗气虚脾弱证，小柴胡汤治疗肝郁气滞证，临证常以两者结合加味化裁。大量研究显示中医健脾理气治疗在延长肝癌患者生存期、提高患者生存质量方面发挥了重要作用[8-9]。

3.2 研究现状

刘晓霓等[10-11]通过肝癌中医临床用药荟萃分析发现单味药用药频率第1～4位的是白术、茯苓、党参、柴胡，常用经典方有四君子汤、小柴胡汤、一贯煎、香砂六君子汤等。罗春蕾等[12]通过实验研究发现四君子汤能促进小鼠肝癌细胞凋亡，影响肿瘤细胞周期，发挥抑瘤作用。李然[13]认为少阳枢机不利是肝癌发病的重要前期因素，提出了小柴胡汤和解枢机在防治肝癌方面的重要地位。李世杰[14]发现肝癌根治术后患者用小柴胡片后，可以降低复发率。王济国等[15]研究发现肝癌肺转移应用小柴胡汤可增强化疗疗效。

综上所述，本研究着眼于四君子汤联合小柴胡汤对小鼠移植性肝癌的抑瘤作用，观察两方联合使用是否较单独使用有更好的疗效，以求为中医治疗肝癌提供更好的方药依据。本研究中，在肿瘤瘤重、肿瘤指数、抑瘤率方面，四君子合小柴胡汤组比两个方药单独使用表现更好的抑瘤效果，在肿瘤细胞凋亡方面，可见到联合使用组比两个单独使用组有更多的肿瘤细胞凋亡，差异均有统计学意义。表明四君子联合小柴胡汤使用比该两方单独使用有更好的抑瘤效果，作用机制可能是诱导肿瘤细胞凋亡，值得进一步研究。

[参考文献]

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[2] 陈玉龙，苗艳艳，吕翠田，等.健脾和胃类方对肿瘤细胞生长抑制的比较研究[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（3）：112-115.

[3] 刘玉红.四君子汤复方总多糖的体外抗肿瘤和免疫活性研究[J].食品与药品，2009，11（5）：22-24.

[4] 赵锦燕，刘丽雅，张毓宸，等.小柴胡汤对人肝癌细胞Huh7细胞凋亡的影响[J].世界中西医结合杂志，2016，11（6）：746-749.

[5] 章红燕，何福根，姜建伟，等.小柴胡汤对H22肝癌小鼠癌细胞的增殖抑制作用及其作用机制研究[J].中华中医药学刊，2014，11（6）：746-749.

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[9] 卢红治.调肝理脾法在肝癌防治中的应用[J].光明中医，2012，25（8）：1480-1481.

[10] 刘晓霓，李宁.原发性肝癌中医临床用药荟萃分析[J].中国中药杂志，2012，37（9）：1327-1331.

[11] 刘鸣昊，李柯柯，张丽慧，等.近10年中医治疗原发性肝癌用药规律研究[J].中国中医药信息杂志，2016，23（9）：45-47.