饲粮铁水平对肉仔鸡锰吸收及组织中沉积的影响

王秋悦，邹亚学，唐家明，吕 林，张丽阳，罗绪刚，李素芬*

（1.河北科技师范学院，河北秦皇岛 066000；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100093）

饲粮铁水平对肉仔鸡锰吸收及组织中沉积的影响

王秋悦1，邹亚学1，唐家明1，吕 林2*，张丽阳2，罗绪刚2，李素芬1*

（1.河北科技师范学院，河北秦皇岛 066000；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100093）

本试验旨在研究饲粮铁水平对肉仔鸡锰吸收及组织中沉积的影响及其机制。将336只1日龄商品代罗斯308肉公雏按体重随机分为4个组，每组6个重复，每个重复14只鸡，分别饲喂不加铁基础饲粮（含铁77.7 mg/kg）、以硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）形式添加铁100、250、500 mg/kg饲粮。28日龄进行原位结扎十二指肠灌注8.74 mmol/L锰测定锰吸收率。结果表明：血浆铁和血浆转铁蛋白饱和度均随饲粮铁水平升高而提高（P＜0.10）；胰腺、十二指肠黏膜和胫骨灰铁含量随饲粮铁水平升高而升高（P＜0.10），锰含量随饲粮铁水平升高而降低（P＜0.10）；3个加铁组十二指肠黏膜二价金属转运蛋白mRNA水平均显著低于对照组（P＜0.10），添加铁500 mg/kg组膜转铁蛋白mRNA水平显著低于对照组和其他2个加铁组（P＜0.10）；加铁组十二指肠锰吸收率均显著低于对照组（P＜0.10）。结果提示，饲粮铁可能通过调控十二指肠黏膜二价金属转运载体的表达降低锰的吸收及组织中的沉积。

铁；锰；二价金属转运蛋白；膜转铁蛋白；肉仔鸡

锰和铁都是动物必需的微量元素，二者在吸收和代谢中存在着复杂的关系。小肠黏膜上的二价金属转运蛋白（Divalent Metal Transporter 1，DMT1）是最早发现的将小肠腔内二价铁转运至细胞内的膜转铁蛋白，也是肠道中唯一的二价锰转运载体[1]，参与大鼠[2]、猪[3]和鸡[4]肠上皮细胞对锰的摄取。膜铁转运蛋白（Ferroportin，FPN1）是最新发现的转运铁的跨膜转运载体[5]，其主要功能是将铁从肠黏膜细胞中转运至血液，可能也参与除铁以外锌、铜、锰、钴和镉的转运[6]。因此，本试验旨在研究饲粮铁水平对肉仔鸡锰吸收及组织中沉积的影响及其机制，进一步揭示锰与铁之间的互作关系，为提高肉鸡锰吸收率、减少锰排出对环境的污染，提供系统、深入的科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计与处理安排 采用单因子完全随机设计，共4个处理组，分别为不加铁基础饲粮组、以硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）形式添加铁100、250、500 mg/kg组。

为观察饲粮铁对锰吸收的影响，在28日龄时，参照白世平[7]方法，每笼按平均体重抽取2只鸡进行结扎十二指肠灌注，结扎肠段长度为10 cm，灌注液为含20 μg/mL 酚红、pH 6.0的5.5 mmol/L Mes-生理盐水溶液，灌注液含锰8.74 mmol/L，灌注量为3.5 mL，灌注时间为30 min。

1.2 试验动物与饲粮 将336只1日龄商品代罗斯308肉公雏按照体重随机分成4个组，每组6个重复，每个重复14只鸡，饲养于不锈钢肉鸡笼中，自由采食和饮自来水（未检测到铁）。试鸡饲养管理按《罗斯肉仔鸡饲养管理手册》进行。

参照我国肉仔鸡营养需要量（2004）配制1～28日龄肉仔鸡玉米-豆粕型基础饲粮（表1，含铁77.7 mg/kg），并按上述处理安排配制添加铁试验饲粮（实测含铁量分别为166、308、579 mg/kg）。试验期28 d。

1.3 样品采集与制备 试验结束时，试鸡禁食8 h后，分别从每个重复笼中选取2只与平均体重相近的试鸡，心脏穿刺采集EDTA抗凝血，4℃保存，用于测定血红蛋白浓度及红细胞压积；采集肝素钠抗凝血，3 000 r/min离心10 min后得血浆，于-20℃保存，用于测定血浆铁及总铁结合力。

将抽过血的试鸡屠宰，用生理盐水冲洗十二指肠2次，然后在距幽门1 cm处剪开十二指肠，用载玻片刮取上部4～5 cm黏膜，液氮速冻后于-80℃冻存，用于相关基因mRNA水平测定，然后刮取下部黏膜10 cm左右，取左侧肝脏、心脏、胰脏和左腿胫骨，-20℃冻存，以备用于测定其中铁和锰含量。每个重复笼中屠宰鸡的样品等量合并为一个样品进行分析。

灌注试验结束后，收集十二指肠灌注液，分析其中酚红和锰含量。每只鸡为1个重复。

1.4 样品分析 根据马新燕[8]采用的方法，将自来水、饲粮、十二指肠黏膜、肝脏、心脏、胰脏、胫骨灰和灌注液用混酸（HNO3和HCIO4按20:1混合） 湿消化后，用电感耦合等离子体发射光谱仪（Model IRIS Intrepid II，Thermal Jarrell Ash，Waltham，MA）测定其中的铁、锰含量。参照白世平[7]方法，用紫外可见分光光度仪（Cary-100，Agilent）测定灌注液中的酚红浓度，并计算锰的吸收率。采用全自动血液分析仪（HC-3000）测定全血红细胞压积及血红蛋白浓度。参照马新燕[8]的方法，采用比色法测定血浆铁和总铁结合力，试剂盒（Cat No.A039和A040）购自南京建成生物技术公司，计算血清铁与总铁结合力的百分比即血铁饱和度。

采用实时荧光定量RT-PCR法测定十二指肠黏膜DMT1和FPN1 mRNA水平。参照白世平[7]所述方法，用Trizol试剂（Invitrogen，Cat No. 15596-026）提取总RNA，用P330-31型核酸分析仪（Implen）测定细胞总RNA的浓度及其在230、260、280 nm的吸光度，计算OD260和OD280的比值，采用1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。参照SuperScript III TM First-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒（Qiagen，Cat No.205311）说明书所述步骤合成cDNA模板。采用SYBR Green 染料试剂盒（ABI，Cat No.4367659）在ABI 7500 PCR仪上对DMT1和FPN1基因进行荧光定量PCR分析，以β-actin基因作为内参进行半定量。所用引物序列见表2，由上海英潍捷基公司合成。每个样品做3次平行测定。

表1 1~28日龄肉仔鸡基础饲粮组成(饲喂基础)

1.5 统计分析 采用 SAS8.0一般线性模型GLM对所有试验数据进行方差分析。若方差分析差异显著，则以最小显著差异LSD法比较各平均数之间的差异显著性。以国际文献报道中通常采用的P＜0.10作为检验差异显著性标准。

2 结果与分析

2.1 饲粮铁水平对肉仔鸡生长性能的影响 由表3可见，饲粮铁水平对肉仔鸡生长性能指标无显著影响（P＞0.10），但日增重和日采食量均有随饲粮铁水平升高而降低的趋势（P＞0.10）。

2.2 饲粮铁水平对肉仔鸡血液指标的影响 由表4可见，饲粮铁水平对血浆总铁结合力、血红蛋白浓度及红细胞压积均无显著影响（P＞0.10），但显著影响血浆铁和血浆转铁蛋白饱和度（P＜0.10），二者均随饲粮铁水平增加而提高（P＜0.10）。

表2 DMT1、FPN1及β-actin引物参数

2.3 饲粮铁水平对肉仔鸡组织铁和锰含量的影响 由表5可见，饲粮铁水平除对28日龄心脏铁含量无显著影响（P＞0.10）外，显著影响其他所测组织铁含量（P＜0.10），这些组织铁含量均随饲粮铁水平增加而提高（P＜0.10）。饲粮铁水平对肝脏和心脏锰含量无显著影响（P＞0.10），但十二指肠黏膜、胰腺和骨灰锰含量均随饲粮铁水平增加而降低（P＜0.10）。

2.4 饲粮铁水平对肉仔鸡十二指肠黏膜DMT1和FPN1mRNA水平及锰吸收率的影响 由表6可见，饲粮铁水平显著影响十二指肠黏膜DMT1和FPN1mRNA水平（P＜0.10），其中加铁组DMT1mRNA水平均显著低于对照组（P＜0.10），且添加铁500 mg/kg组DMT1mRNA水平也低于其他2个添加铁组（P＜0.10）。添加铁500 mg/kg组FPN1mRNA水平显著低于对照组和其他2个添加铁组（P＜0.10），其他3组间差异不显著（P＞0.10）。饲粮铁水平显著影响原位结扎十二指肠中锰的吸收率（P＜0.10），其中加铁组锰吸收率均显著低于对照组（P＜0.10），且添加铁500 mg/kg组锰吸收率也低于其他2个添加铁组（P＜0.10）。

表3 饲粮铁水平对1～28日龄肉仔鸡生长性能的影响

表4 饲粮铁水平对28日龄肉仔鸡血液指标的影响

表5 饲粮铁水平对28日龄肉仔鸡组织铁和锰含量的影响(鲜基) µg/g

表6 饲粮铁水平对28日龄肉仔鸡十二指肠黏膜DMT1和FPN1mRNA水平及锰吸收率的影响

3 讨 论

3.1 饲粮铁水平对肉仔鸡生长性能的影响 玉米-豆粕型饲粮中添加100 mg/kg铁对1～21日龄肉仔鸡采食量和日增重均无显著影响[8]，但添加400～800 mg/kg铁降低采食量和日增重[9]。本试验中添加铁250、500 mg/kg组采食量和日增重均有降低的趋势，说明此时机体可能已经呈现铁临界过量的状态。

3.2 饲粮铁水平对肉仔鸡血液指标的影响 尽管动物缺铁会导致血红蛋白浓度降低，但在不缺铁饲粮中添加100～500 mg/kg铁并不增加血红蛋白浓度[3]。本试验中对照组与添加铁组间血红蛋白浓度和红细胞压积均未表现出差异，可能与本试验中所用饲粮含铁较高、此时鸡只仅临界缺铁有关。血浆转铁蛋白饱和度低于16%说明体内铁缺乏，超过60%则说明铁过量[10]。本试验饲粮中添加铁250 mg/kg组转铁蛋白饱和度接近60%，说明鸡只处于临界铁过量状态，添加铁500 mg/kg组转铁蛋白饱和度超过60%，说明鸡只处于铁过量状态。

3.3 饲粮铁水平对肉仔鸡组织铁和锰含量的影响断奶仔猪饲粮中添加铁100、500 mg/kg，肝脏和十二指肠铁含量线性增加而锰含量线性降低[3]。断奶犊牛饲粮中添加750 mg/kg铁显著提高肝脏铁含量，但仅有十二指肠锰含量显著降低[11]。蛋鸡采食添加锰300 mg/kg饲粮6周后，十二指肠和肝脏中锰含量升高而铁含量降低[12]。本试验中肝脏、胰腺、十二指肠和胫骨灰铁含量随饲粮铁添加水平升高而增加，胰腺、十二指肠和胫骨灰锰含量随饲粮铁添加水平升高而降低，强烈提示饲粮铁和锰在吸收和代谢中存在拮抗关系。

3.4 饲粮铁水平对肉仔鸡十二指肠DMT1和FPN1mRNA水平及锰吸收率的影响 断奶大鼠饲喂添加2%羧酸铁的高铁饲粮2周后，十二指肠中与铁吸收转运相关的基因Dcytb、DMT1、FPN1和TfR1mRNA水平均明显降低[13]。8日龄肉仔鸡饲喂含铁51 mg/kg和141 mg/kg饲粮6周后，高铁组十二指肠中DMT1、FPN1和DcytbmRNA水平均低于低铁组[14]。蛋鸡采食添加锰300 mg/kg饲粮6周后，十二指肠DMT1mRNA水平降低，但FPN1mRNA水平升高[12]。本试验中添加铁组十二指肠黏膜中DMT1mRNA表达量明显低于对照组，且与锰吸收率表现出相同的趋势，强烈提示饲粮铁可能通过降低DMT1mRNA表达量而降低了锰的吸收。只有500 mg/kg铁组十二指肠黏膜中FPN1mRNA表达量明显低于对照组，这可能与FPN1位于基底膜、其表达量受肠黏膜细胞内铁含量调控有关。

4 结 论

肉仔鸡十二指肠黏膜中DMT1和FPN1mRNA表达量、原位结扎十二指肠对锰的吸收率及胰腺、十二指肠和胫骨灰锰含量均随饲粮铁水平升高而降低，表明饲粮添加铁可能通过调控十二指肠黏膜DMT1和FPN1的表达量降低了锰的吸收及组织中的沉积。

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Effect of Dietary Iron Level on Manganese Absorption and Deposition of Broilers

WANG Qiu-yue1, ZOU Ya-xue1, TANG Jia-ming1, LV Lin2*, ZHANG Li-yang2, LUO Xu-gang2, LI Su-fen1*
(1.Hebei Science and Technology Normal College, Hebei Qinhuangdao 066000, China; 2. Institute of Animal Sciences of CAAS, Beijing 100093,China)

This experiment was conducted to investigate the effect of dietary iron (Fe) level on manganese (Mn) absorption and deposition in broilers. A total of 336 1-day-old Rose-308 male chicks were divided into 4 groups with 6 replicates and 14 chicks each replicate cage, and fed the basal diet (control, containing Fe 77.7 mg/kg) or basal diet supplemented with 100, 250, or 500 mg Fe/kg for 28 days. Ligated duodenal loops were perfused with 8.74 mmol/L of Mn to determine the Mn absorption. The results showed that plasma Fe content and transferrin saturation increased (P＜0.10) as dietary Fe level increased. The Fe contents in pancreas, duodenal mucosa, and tibia ash increased (P＜0.10) and the Mn contents in above mentioned tissues decreased (P＜0.10) as dietary Fe level increased. The DMT1 mRNA levels of Fe-supplemented groups were lower (P＜0.10) than that of the control, and theFPN1mRNA level of Fe-supplemented 500 mg/kg group was lower (P＜0.10) than those of the control and the other two Fe-supplemented groups. The Mn absorption rates of Fe-supplemented groups were lower (P＜0.10) than that of the control. These results suggested that dietary Fe might decrease the absorption and deposition of Mn through the down-regulations ofDMT1andFPN1gene expression in duodenal mucosa of broilers.

Iron; Manganese; Divalent Metal transporter 1; Ferroportin; Broiler

S831.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-05-068

2016-11-24；

2016-12-26

国家自然科学基金（31272465）

王秋悦（1980-），女，河北唐山人，副教授，博士，主要从事分子生物学研究，E-mail: wangqiuyue1980@163. com；并列第一作者：邹亚学（1972-），男，河北迁安人，副教授，博士，主要从事分子生物学研究，E-mail: zouyaxue@163.com

* 通讯作者：吕林，副研究员，硕士生导师，E-mail：lulin1225 @163.com；李素芬，教授，硕士生导师，E-mail: lisufen88@ aliyun.com