鸽SPAG6基因多态性与精子活力、体尺性状的相关性研究

胡 平，李国勤，刘雅丽，陈圆圆，赵婉秋，杨 颖，陶争荣，卢立志*

（1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江杭州 310021；2.南京农业大学动物科技学院，江苏南京 210095；3.浙江省畜牧技术推广总站，浙江杭州 310021）

鸽SPAG6基因多态性与精子活力、体尺性状的相关性研究

胡 平1,2，李国勤1，刘雅丽3，陈圆圆1,2，赵婉秋1，杨 颖1，陶争荣1，卢立志1*

（1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江杭州 310021；2.南京农业大学动物科技学院，江苏南京 210095；3.浙江省畜牧技术推广总站，浙江杭州 310021）

为探讨鸽精子相关抗原6蛋白（SPAG6）基因单核苷酸多态性（SNPs）及其与鸽精子活力和体尺性状之间的关系，选择98只12月龄银王鸽，采用DNA直接测序法对SPAG6基因部分片段进行SNPs筛选。结果表明：在SPAG6基因编码区和非编码区分别发现2个和7个突变位点，其中G26789T位点BB基因型个体精子活力显著高于AB基因型（P＜0.05），AA基因型个体胫长均值显著高于BB基因型（P＜0.05）；C16181G和C16336T位点与胫围显著相关（P＜0.05），BB基因型为优势基因型；T27507C位点AA基因型个体胫围均值显著高于AB基因型（P＜0.05）；T30364C位点3种基因型个体胸宽差异显著，其中BB基因型为优势基因型（P＜0.05）。由此可见，SPAG6基因与精子活力和体尺性状密切相关，可以作为银王鸽精子活力与体尺性状分子标记的候选基因。

鸽：精子相关抗原6蛋白（SPAG6）；单核苷酸多态性（ SNPs）；精子活力；体尺性状

精子相关抗原6蛋白（Sperm Associated Antigen 6，SPAG6）是一种主要集中在轴丝中心粒上，参与调控精子发生、成熟以及受精等反应的重要功能蛋白[1-2]。SPAG6基因在哺乳动物的神经系统、肺、睾丸等组织中均有表达，其中在睾丸生殖的细胞中表达量最高[3]。目前，SPAG6基因的研究基本以小鼠为主。研究表明[4]，SPAG6不仅可以调节鞭毛运动，还与胚胎纤维化密切相关。当SPAG6蛋白缺失时，小鼠会出现生殖功能障碍现象[5]。Cooley等[6]发现SPAG6基因在小鼠的初级和次级淋巴细胞中均有表达，当其缺失会引起免疫突触间隙中心体两极分化和肌动蛋白间隙损失从而导致免疫下降。鸽SPAG6基因共有9个外显子和8个内含子，基因全长为39 170 bp（GenBank号：NW_004973238.1 ）。目前，禽类SPAG6基因鲜有报道。因此，本实验通过对银王鸽SPAG6基因单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs）检测，分析其多态性与银王鸽精子活力和体尺性状等相关性，探索和研究SPAG6基因的遗传变异对鸽精子活力和体尺性状的影响，为提高鸽的选育工作效果提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 银王鸽群来自北京霍书林养殖场，常规饲养。鸽群全程笼养，随机选取98只12月龄银王雄鸽进行精子活力以及体尺性状测定，空腹12 h后进行称重和翅静脉采血，血样以20%EDTA抗凝，-20℃保存，用于抽提DNA。

1.2 精子活力和体尺测定 正式实验前先对150只12月龄银王雄鸽进行采精训练，每只每天训练1 min，连续训练3 d，隔2 d后进行精液采集、活力鉴定和体尺测量，其中每份精液测定3次取均值作为实验数据，具体测量方法如下：

精子活力：取精液1滴，置于小试管中，用等温的0.9%生理盐水进行稀释，以保持精子的正常运动，在400倍生物显微镜下观察，估测直线运动的精子占总精子数的百分比，以此评定出活力。精子活力（%）=呈直线前进运动精子数/总精子数。

体尺测定方法参照NY/T823-2004要求进行测定[7]。

1.3 DNA提取与检测 用酚-氯仿抽提法提取鸽血液基因组DNA，通过0.8%琼脂糖凝胶电泳和OD260/OD280比值判断DNA纯度和浓度，并用TE稀释至最终浓度为60 ng/μL，-20℃保存。

1.4 引物设计与合成 用Primer 5和Oligo 6软件设计6对上下游引物，引物信息见表1，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 鸽SPAG6基因多态性检测引物

1.5 PCR扩增 PCR反应体系为50 μL，其中10×Buffer 5.0 μL，MgCl25.0 μL，2 mmol/L dNTPs 1 μL，上下游引物各1.0 μL，模板DNA 50.0 ng，1U Taq DNA聚合酶1.0 μL，加ddH2O补齐体积至50.0 μL。PCR扩增程序：94℃预变性3 min；94℃变性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，35个循环；最后72℃延伸3 min。

1.6 统计分析 采用Chromas Version 1.62 导出测序图谱文件，用DNAMAN比对序列，找到突变位点，再结合Chromas图谱中波峰的颜色及单、双峰情况，判断每个样本突变情况，生成Excel数据表格。利用POPGENE 32-version 1.31.1对基因型频率、等位基因频率、杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）和多态信息含量（PIC）进行统计分析，对数据进行χ2检验，分析Hardy-Weinberg平衡状态。运用SPSS 22.0分析突变位点与精子活力和体尺的关联性。

2 结果与分析

2.1 PCR产物检测 6对设计合成的引物在正常条件下扩增出清晰、特异性高的PCR产物，且与预期目的片段长度一致（图1），可进行后续测序。

图1 SPAG6基因6个片段PCR扩增

2.2 基因分型 将测序结果运用Chromas和DNAMAN软件比对、分析，在SPAG6基因6个片段中共检测到了9个突变位点（C16181G、G16202A、C16309T、C16336T、G26789T、T27507C、T30364C、A30376G、A34212G），结果见表2。

表2 SPAG6基因突变位点等位基因与基因分型分析

2.3 基因型频率、等位基因频率和群体遗传学分析 分别对98只银王鸽个体SPAG6基因的9个位点进行群体遗传学分析。由表3可知，除了G26789T位点处于低度多态，其余位点均处于中度多态；卡方检验结果表明，G16202A和C16309T位点偏离Hardy-Weinberg平衡状态（P＜0.05），其他位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05）。

2.4SPAG6基因SNPs对精子活力和体尺的影响 根据SPAG6基因突变检测结果进行个体SNP分型，采用最小二乘法分析各个位点不同基因型与12月龄银王鸽精子活力、体重、体斜长、龙骨长、胫围、胫长、胸宽、骨盆宽和胸深9个性状的关系，结果见表4。由于突变位点和性状较多，表4只列举了不同基因型个体差异显著的性状。

表3 SPAG6基因多态位点的遗传参数分析

表4 银王鸽SPAG6基因序列SNPs与精子活力和部分体尺的关系

由表4可知，G26789T处BB基因型个体精子活力显著高于AB基因型（P＜0.05），AA基因型个体胫长均值显著高于BB基因型（P＜0.05）；C16181G和C16336T位点BB基因型个体胫围均值显著高于AA、AB基因型（P＜0.05）；而T27507C位点AA基因型个体胫围均值显著高于AB基因型（P＜0.05）；T30364C位点3种基因型对胸宽有显著影响，BB基因型个体胸宽均值显著高于AA基因型（P＜0.05）。

3 讨 论

本研究在SPAG6基因6个片段中共检测到了9个突变位点，其中编码区中有2个突变位点，非编码区中有7个突变。有学者指出非编码区虽对蛋白表达无直接影响，但是会通过改变基因转录效率而影响基因的表达[8-9]。本实验结果表明编码区(C16181G)和非编码区(C16336T、G26789T 、T27507C、T30364C)的突变均可影响精子活力和体尺，这可能是由于非编码区内存在增强或抑制转录元件影响SPAG6基因转录，从而改变鸽精子活力和体尺性状。

目前，SPAG6基因已被证实与动物精液品质有显著影响。Sapiro等[10]发现当小鼠缺乏SPAG6基因时，其精子活力明显下降，且存在精子结构形态异常现象。这说明SPAG6基因中存在调节小鼠精子活力的调控元件。毕瑜林等[11]研究发现，北京油鸡SPAG6基因C29657T和T23041C与精液量、精子活率和精子畸形率显著相关，而与精子活力不存在显著关系。胡娟[12]研究表明，油鸡SPAG6基因中存在位点与精液品质之间具有显著关系。本研究发现，G26789T位点与银王鸽精子活力有显著关系，BB基因型银王鸽精子活力显著高于AB基因型，这表明SPAG6基因可能参与和调控精子运动过程。另外，本研究还发现鸽SPAG6基因9个突变位点中，2个位点(G16202A、C16309T)不处于Hardy-Weinberg平衡，其余位点均处于Hardy-Weinberg平衡。多态信息含量(PIC)是衡量等位基因片段多态性的理想指标，当0.5＜PIC＜0.25(中度多态)时，遗传变异较大；当PIC＜0.25(低度多态)时，遗传变异较小。本实验中所有位点PIC均小于0.5，其中G26789T位点处于低度多态，其余均处于中度多态，这表明SPAG6基因在今后遗传选育中可发挥较大作用。

体尺性状是家禽选育中的重要表型性状，直接或间接影响其生产性能，也是衡量家禽健康的重要指标[13]。体尺性状与其个体遗传紧密联系，而SPAG6基因通过影响动物生殖功能间接改变动物遗传效应。目前，还未有关于SPAG6基因与体尺性状相关性的研究。本试验研究了SPAG6基因与银王鸽体尺之间的关联分析，结果显示C16181G、C16336T、T27507C位点显著影响银王鸽胫围，其中C16181G、C16336T位点有3种基因型，BB基因型个体胫围显著高于AA基因型，而T2750位点的AA基因型为优势基因。另外，G26789T和T30364C位点突变分别与胫长和胸宽呈显著关系，这说明SPAG6基因可能参与鸽体尺性状的调控，C16181G、C16336T、G26789T 、T27507C、T30364C位点可作为鸽体尺性状的候选分子标记位点。

4 结 论

本研究首次在鸽中研究了SPAG6基因的多态性并分析其与精子活力和体尺性状等的相关性。SPAG6基因的G26789T位点与精子活力显著相关，C16181G、C16336T、G26789T、T27507C、T30364C位点与相应体尺性状呈显著相关。因此，SPAG6基因G26789T位点可以作为鸽精液品质候选分子标记位点，且C16181G、C16336T、G26789T 、T27507C、T30364C位点可作为鸽体尺性状的候选分子标记位点。但由于本实验样本数量较少，因此本实验结果是否适合其他品种的鸽子还需进一步验证。

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Abstract:In order to analyze the correlation between the single nucleotide polymorphisms(SNPs) ofSPAG6and sperm motility, body measurements of pigeon, ninety eight twelve-month-old Silver King Pigeons were screened by DNA direct sequencing .The results showed that two mutation sites were found in coding region and seven mutation sites were found in non-coding region. The genotype BB of the mutation site of G26789T was significantly higher than genotype AB in sperm motility (P＜0.05), tibia length of genotype AA of this site was significantly longer than that of genotype BB (P＜0.05). In addition, the mutation sites of C16181G and C16336T were significantly associated with shank girth, genotype BB was the advantage genotype (P＜0.05). The mutation site of T27507C was correlated to the shank girth, and Genotype AA was significantly higher than genotype BB in shank girth (P＜0.05). The mutation site of G26789T which had three genotypes was significantly related to chest width, and genotype BB was the advantage genotype (P＜0.05). The results indicate thatSPAG6gene is closely related to sperm motility and body measurements, and can be used as a molecular marker for sperm motility and body measurements in marker assisted selection (MAS) for Silver King Pigeon.

Correlation of Single Nucleotide Polymorphisms of Sperm Associated Antigen 6 Gene with Sperm Motility and Body Measurements in Pigeon

HU Ping1,2, LI Guo-qin1, LIU Ya-li3, CHEN Yuan-yuan1,2, ZHAO Wan-qiu1,YANG Ying1,TAO Zhen-rong1, LU Li-zhi1*
(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science, Zhejiang Academy of Agricultural sciences, Zhejiang Hangzhou 310021, China; 2.College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Jiangsu Nanjing 210095,China; 3.Animal Husbandry Technology Extension Station of Zhejiang Province, Zhejiang Hangzhou 310021, China)

Pigeon; Sperm associated antigen 6(SAG6);Single nucleotide polymorphism (SNPs); Sperm motility; Body measurement

S839.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-05-042

2016-10-09；

2016-11-06

浙江省农业科学院地方科技合作项目（WZ201400 02）；重点科学技术研究开发计划（GKZ101503）；湖州市攻关计划农业项目（2016GN07）

胡平（1991-），男，江苏仪征人，硕士，研究方向为动物环境生理营养，E-mail: huping0514@foxmail.com

* 通讯作者：卢立志，研究员，硕士生导师，E-mail: lulizhibox @163.com