19例线粒体脑肌病的电子显微镜研究

陈 晨 孙异临 张在强 李少武 张 岩 王芹芹 张翠萍 皇埔秉轩

(1.首都医科大学 北京市神经外科研究所,北京100050；2.陆军总医院 八一脑科医院，北京100007)

19例线粒体脑肌病的电子显微镜研究

陈 晨2孙异临1*张在强1李少武1张 岩2王芹芹2张翠萍1皇埔秉轩2

(1.首都医科大学 北京市神经外科研究所,北京100050；2.陆军总医院 八一脑科医院，北京100007)

目的：探讨线粒体脑肌病的超微病理特点和发病机制。线粒体脑肌病MELAS (mitochondrial encephal myopathy with lactic acidosis and strokelike episodes)是一种以卒中样发作同时伴有血乳酸增高为主要临床表现的线粒体病，病因为遗传性基因缺陷所致。方法：对19例线粒体脑肌病患者肌肉活检标本的超微病理变化及核磁共振特点进行分析。结果：研究提示核磁共振检查MELAS病患者大脑颞、顶、枕皮层可见不按血管解剖学分布的梗死样病灶；电子显微镜检查见病变肌细胞内线粒体形态异常，出现矩阵样结晶包涵体结构。结论：MELAS的诊断需结合临床、病理、电镜、影像、血清学和基因检查，其中肌肉活检的电子显微镜检查可作为金标准。

线粒体脑肌病 超微病理 电子显微镜

线粒体脑肌病(MELAS)多发生在青少年，是以脑和肌肉受累为主的多系统病变，临床症状为全身性表现，可以有头痛、呕吐、发作性癫痫，此外还可见卒中样发作，患者智力低下、生长缓慢、身材矮小、肌肉无力、骨骼肌极度不能耐受疲劳、视听能力下降等，血清学检查可见血乳酸水平明显升高，肌酶升高〔1〕。

1 临床资料和方法

本组共19个病例，其中男性16例，女性3例，青少年发病，临床症状表现为卒中样发作，血清学检查均可见血乳酸水平升高。其他症状和体征有头痛、发作性癫痫，智力低下、身材矮小、骨骼肌不能耐受疲劳、听力下降等。

标本制备：送检标本为患者腓肠肌,于手术台边取材新鲜标本即刻置入2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液内进行初固定，0.1M二甲砷酸钠缓冲液(pH7.4)冲洗后用Leica自动组织处理机处理标本，先后经1%四氧化锇后固定，双蒸水冲洗，梯度乙醇脱水至环氧丙烷，SPI812浸透包埋；制备1μ半薄切片，天青-美蓝染色，光学显微镜检查；光镜定位后用Leica UC6型超薄切片机制备40纳米厚度超薄切片，经醋酸双氧铀、柠檬酸铅染色，在日立H-7650透射电子显微镜观察及Gatan 832CCD相机拍照。

2 检查结果

神经影像学MRI检查表现为大脑后半部的颞、顶、枕皮层及白质区见梗死样病灶，可见颞顶枕皮层多发层状长T1、T2异常信号，梗死样病灶特点为不按血管的解剖学分布，即病灶与脑动脉供血分布区域不一致，梗死灶周围无强化(图1)。

图1 MRI颞顶枕皮层多发异常信号，梗死样病灶不按血管的解剖学分布

病理学检查可见病变肌细胞与正常肌细胞混合镶嵌在一起，病变细胞在改良Gomori染色时出现不规则的红色边缘(ragged-red fibers RRF)(图2)；还原型辅酶Ⅰ四唑氮还原酶(NADH)染色可见肌膜下深染(图3)；PAS及油红O染色可见糖原和脂质沉积。

图2 改良Gomori染色时出现不规则的红色边缘

电子显微镜检查见病变肌细胞的肌膜下和肌原纤维之间线粒体明显增多且形态异常(图4)、线粒体内矩阵样结晶包涵体的结构变化多样，可见不规则的几何图形线粒体、也有的呈规则的晶体样结构或呈同心圆状(图5)；部分病例除病变肌细胞内线粒体数量及形态异常外，同时可伴有糖原颗粒及脂类物质聚集在肌丝之间(图6)。

图4 病变肌细胞的肌膜下和肌原纤维之间线粒体明显增多

图5 病变肌细胞内见不规则几何图形线粒体、有的呈规则的晶体样结构

图6 肌细胞内肌丝断裂，线粒体形态异常，同时伴有糖原颗粒蓄积

3 讨论

MELAS的脑卒中样发作可累及大脑后半部的颞、顶、枕皮层及白质区，病变范围较广且具有一定的对称性，梗死灶周围无强化无明显水肿。CT及核磁共振等神经影像学检查对线粒体脑肌病诊断具有重要辅助作用，常可见到苍白球、丘脑、基底节钙化，脑室周围白质病变以及不按血管解剖学分布的多发脑梗塞。如进行MR波谱成像检查，磁共振波谱可以检测组织内能量代谢和生化的改变，显示脑内病灶中乳酸含量可进一步明确诊断。本组病例MELAS患者MRI检查可见颞顶枕皮层多发层状长T1，T2异常信号，病灶特点不按血管的解剖学分布即梗死样病灶与脑动脉供血分布区域不一致，病灶处血管分支少，血流量低下，这一点与缺血性脑梗死病灶的分布不同，说明线粒体脑肌病是线粒体功能异常引起的脑内微小血管病变，不累及颅内大的血管，所以是代谢性脑梗塞〔2〕。脑电图检查在伴有癫痫发作的线粒体脑肌病患者有一定意义，以皮层损害为主的病变表现为弥散性全脑的异常脑电波；部分病例也可见局灶性的改变，出现癫痫特有的棘慢波；肌电图检查多表现为肌源性损害改变，也有部分患者同时出现肌源性或和神经源性损害改变。由于线粒体功能异常ATP合成受阻，无氧糖酵解增多，因而出现相应的临床症状，如肌无力及不能耐受疲劳等〔3〕，患者血清学检查乳酸升高是一项重要的诊断指标。

线粒体脑肌病的病理学检查是诊断该病的必要手段，肌肉组织活检可见呼吸链酶缺失的病变肌细胞与正常骨骼肌细胞混合镶嵌在一起，这种线粒体异常增多的病变肌细胞在改良Gomori染色时肌细胞出现不规则的红色边缘，这种红色边缘肌纤维(ragged-red fibers RRF)是由于ATP合成不足肌细胞为代偿而产生的肌酸激酶沉积所致；还原型辅酶Ⅰ四唑氮还原酶(NADH)染色可见到肌膜下深染的肌细胞；PAS及油红O染色可见糖原和脂质沉积，同时可见病变肌细胞变性、大小不等及细胞核内移的现象〔4〕。

电子显微镜检查见病变肌细胞的超微结构变化复杂，肌膜下和肌原纤维之间线粒体数量明显增多且形态异常、线粒体内矩阵样结晶包涵体的结构变化多样〔5〕，有些为不规则的几何图形、也有的呈高度规则的晶体、或呈周期性编织样结构也可以呈同心圆状〔6〕，这些结构的产生是线粒体功能损害的结果还是导致线粒体功能丧失的原因尚不清楚。线粒体内不同类型的结晶样包涵体可能与不同性质的蛋白质聚集有关，也可能是同一种蛋白在不同病变阶段的异常合成所致〔7〕。线粒体在糖原、脂肪代谢过程中关系密切，由于线粒体功能异常能量代谢障碍，常常累及糖原和脂质的代谢异常，因此部分病例在病变肌细胞内线粒体变化的同时可伴有糖原颗粒及脂类物质聚集，也可见较多脂褐素，这些糖原和脂类物质的积聚均继发于线粒体功能的障碍，同时过多的脂肪累积反过来又抑制线粒体内酶的功能〔8〕，肌细胞内脂肪代谢障碍造成的脂质堆积是引起肌肉极度不能耐受疲劳的原因之一。

线粒体是与机体内能量代谢相关的细胞器，即细胞内氧化磷酸化的场所。在线粒体的遗传学研究中已知，线粒体具有母系遗传的独立基因即线粒体DNA(Mitochondrial DAN, mtDNA)，线粒体DNA是人体细胞中唯一的核外DNA， mtDAN编码的蛋白质只有十几种，主要是细胞色素b、细胞色素c、NADH脱氢酶和氧化酶的亚单位，具有全套的呼吸链酶体系，其功能主要是氧化底物，利用呼吸链电子传递合成的ATP。Goto报道MELAS的基因突变位点主要为线粒体tRNA亮氨酸基因的A3243G核苷酸的点突变，由A变为G是导致线粒体脑肌病的主要致病因素，少部分是T3271C位置的点突变〔9〕。这种遗传缺陷导致线粒体蛋白质翻译、合成错误，引起线粒体呼吸链受损，造成线粒体酶系缺乏以致氧化磷酸化异常，最终引起线粒体脑肌病的发生。在线粒体功能发生障碍时，三磷酸腺苷ATP生成减少，导致ATP阈值较高的器官如脑组织、骨骼肌和心肌等高度依赖氧化磷酸化代谢的高耗氧量组织出现功能衰竭，引起全身多器官受累，当引起中枢神经系统发生病变时即为线粒体脑肌病MELAS。此外由于mtDNA不与组蛋白结合，因此其编码的蛋白质容易受到活性氧自由基的损害，当mtDNA损害积累增多时就会造成线粒体结构和功能异常，继而引起线粒体病。另外由于mtDNA没有修复系统，线粒体DNA的突变、重复、缺失即可导致线粒体病的发生，同时线粒体还参与活性氧产生和诱导凋亡的病理过程，因此当线粒体内膜上细胞色素c激活caspase蛋白通道时即可导致细胞凋亡。

临床工作如见到青少年脑卒中样发作，同时伴有高乳酸血症的患者，应高度警惕线粒体脑肌病。患者的脑卒中样发作是由于局部脑组织ATP合成减少所致，并不是缺血性梗死。患者高乳酸血症是由于线粒体病变导致ATP生成减少，为代偿氧化磷酸化不足，组织内糖解酵代谢亢进，引起的血清内乳酸蓄积。

研究结果提示：(1)MELAS的诊断需结合临床、病理、电镜、影像、血清学和基因检查，其中肌肉活检的电镜诊断最为重要，因为电镜检查可以得到具有决定性诊断意义的形态学证据，因此这项检查是诊断线粒体病的金标准；(2)MRI证实线粒体脑肌病引起的卒中样发作是线粒体功能异常引起的脑内微小血管病变，不累及颅内大的血管；(3)患者血清内乳酸升高是由于线粒体病变导致三磷酸腺苷ATP生成减少，组织内糖解酵代谢亢进所致，是引起肌无力和肌肉疼痛的原因之一；(4)线粒体功能异常累及糖原和脂质的代谢异常，引起糖原和脂类物质的积聚是引起肌肉极度不能耐受疲劳的原因。

[1]Kobayashi Y, Momoi MY, Tominaga K, et al . Respiration deficient cells are caused by a single point mutation in mitochondrial tNRA-Leu (UUR) gene in mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis and strokelike episodes(MELAS)〔J〕.Am J Hum Genet,1991,49:590-599.

[2] 卢岩，王向波.线粒体脑肌病MELAS型的影像学和病理学特征〔J〕.中国脑血管病杂志, 2006，3(2):81-86.

[3] Kaufinann P， Shungu D C, Sano M C, et al. Cerebral lactic acidosis correlates with neurological impairment in MELAS. Neurology ,2004,62(8):1297-1302.

[4]陈清棠， 李晓东.原发性线粒体肌病和脑肌病〔J〕. 临床神经病学杂志,2003,16(4)：249-250.

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[9] Goto Y I, Nonaka I A, Mutation in the tRNA Leu(UUR) gene assotiated with the MELAS subgroup of the mitochondrial encephalomyopaties 〔J〕.Nature 1990,348:651-656.

TEM investigation on ultrastructural pathology of mitochondrial encephal myopathy.

Chen Chen2, Sun Yilin1*Zhang Zaiqiang1, Li Shaowu1, Zhang Yan2, Wang Qinqin2, Zhang Cuiping1, Huangpu Bingxuan2

(1.Beijing Neurosurgical Institute,Capital Medical University,Beijing 100050,China; 2.Brain Hospital,Army General Hospital , Beijing 100007,China))

In this paper, ultrastructural pathological change and MRI feature of muscle biopsy specimens of mitochondrial myopathy in 19 cases were analyzed. MRI examination indicated that there were infarct-like lesions in cerebral temporal, top and occipital cortex, the vascular distribution was not according to anatomy. Electron microscopy showed abnormal mitochondrial morphology changes in muscle cells and matrix like crystalline inclusions structure. MELAS diagnosis should be combined with clinic, pathology, electron microscopy, imaging, serology and genetic examination, of which the electron microscopic diagnosis of the muscle biopsy is the most important.

mitochondrial encephalo myopathy；ultrapathology;electron microscopy

陈晨，女，1988年出生，毕业于内蒙古医科大学，大学本科，工作单位：陆军总医院附属八一脑科医院电镜室。

*通讯作者：孙异临 ,男，1952年出生， 研究员，E-mail:13020068718@163.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2017.02.013

2016-12-06