藏药蓝侧金盏花的挥发油成分分析及其抑菌活性研究

钱 帅，包婷雯，南杰东智，卢永昌，李海丽

（1青海民族大学药学院，西宁 810007；2青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室，西宁 810007；3青海省药物分析重点实验室，西宁 810007）

藏药蓝侧金盏花的挥发油成分分析及其抑菌活性研究

钱 帅1，2，3，包婷雯1，3，南杰东智1，2，卢永昌1，2，3，李海丽1，2，3

（1青海民族大学药学院，西宁 810007；2青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室，西宁 810007；3青海省药物分析重点实验室，西宁 810007）

采用水蒸气蒸馏法获得藏药蓝侧金盏花的挥发油，对其进行GC-MS分析，并运用滤纸片扩散法初步研究了该挥发油的抑菌活性。结果表明：对蓝侧金盏花挥发油GC-MS分析得到34种匹配度均在85%以上的化学成分，占总离子峰相对含量的64.17%，其主要成分包括蒈烯（9.70%）、α蒎烯（5.70%）和红没药醇（482%）。纸片扩散法测试藏药蓝侧金盏花挥发油对7种革兰氏阴性菌和1种革兰氏阳性菌有较好的抑制活性，对3种供试真菌无抑制作用。

蓝侧金盏花；挥发油；GC-MS；抑菌活性

蓝侧金盏花（Adonis coerulea Maxim）为毛茛科侧金盏花属多年生草本植物，茎高3—15 cm，4—7月份开花，分布于我国四川、青海、西藏和甘肃等海拔3 350—5 200 m的高山灌丛或草地［1］。据《晶珠本草》记载，蓝侧金盏花味苦，性糙，气味毒臭，食后致人欲死；外敷治疮疖、肉瘤、癣疥、麻风、皮肤病［2］。《藏药晶镜本草》记载，蓝侧金盏花生长在沙砾、沟槽、树林之间；味苦、性糙、气毒大，食后致人濒临死，外涂治疗疮、疣，癣疥麻风肿核疮，黄水疮等皮肤病，单药一涂即痊愈［3］。尚小飞等［4］在藏兽药蓝侧金盏花对兔螨的抑杀作用研究中认为，蓝侧金盏花乙酸乙酯提取物具有良好的杀兔螨活性。安再强等［5］研究认为，与常用的抗真菌类中西药相比，蓝侧金盏花具有良好的抑制石膏样毛癣病效果。戴源等［6］在蓝侧金盏花的化学成分中分离得到8个化合物。基于古典经验记载和现代药理研究，蓝侧金盏花可能在治疗皮肤病方面有着独特的疗效。

目前，关于侧金盏花属植物挥发油化学成分及药理研究尚属空白。本试验采用水蒸气蒸馏法［7］提取蓝侧金盏花挥发油，并结合气质联用手段对蓝侧金盏花挥发油进行化学成分分离和鉴定；用纸片扩散法和MIC法研究蓝侧金盏花挥发油的体外抗菌效果，以期探明蓝侧金盏花对各个菌种抗菌能力的强弱，为蓝侧金盏花的深层次研究及应用开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

蓝侧金盏花于2015年7月采自青海省平安县寺台乡，经青海民族大学卢永昌教授鉴定为藏药材蓝侧金盏花。蓝侧金盏花全草粉碎过40目筛备用。

1.2 仪器与试剂

7890/5975C-GC/MSD气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司）；NIST MS search 2.0质谱检索数据库（美国安捷伦公司）；MSD Chemstation D.03.00.611色谱数据处理系统（美国安捷伦公司）；SW-CJ-2FD型净化工作台（苏州净化设备有限公司）；AS-1060L型高压灭菌锅（邝杏生物技术有限公司）。

混合正构烷烃对照品（C7-C30）（上海安谱科学仪器公司）；丙酮、乙醚等试剂均为国产分析纯。供试菌种见表1。

表1 供试菌种汇总Table 1 Summary of test strains

1.3 方法

1.3.1 水蒸气蒸馏法萃取

准确称量100 g蓝侧金盏花药材粉末于圆底烧瓶中，加入300 m L蒸馏水浸泡12 h，用水蒸气蒸馏法热回流萃取挥发油。将馏出液用乙醚反复萃取3次，同时用无水硫酸钠干燥，按下式计算挥发油提取率：Y＝V/m；式中：V为挥发油体积（mL）；m为药材质量（g）。

1.3.2 GC-MS分析

色谱柱：弹性石英毛细管柱HP-5型（30 m×250μm，0.25μm）；载气（流量）为氦气（1 mL/min）；进样口温度为250℃；设定顶空进样的程序升温条件：初始温度为45℃，保持0 min，以1.5℃/min升至80℃，保持1 min；以10℃/min升至120℃，保持1 min；以0.8℃/min升至170℃，保持1 min；以8℃/min升至260℃，保持5 min。

质谱条件：标准质谱调谐；EI离子源；离子源温度为230℃；电子能量为70 eV；四级杆温度为150℃；辅助区温度为295℃；数据采集扫描模式为全扫描；溶剂延迟时间0 min；质谱扫描质量范围50—550 u；质谱检索标准库为NIST08库［8］。

1.3.3 KI值测定

精确量取20μL正构烷烃混合对照品（C7—C30）于10 mL顶空瓶中，按照1.3.2条件顶空进样分析，用于蓝侧金盏花挥发油各组分的KI值（相对保留值）计算；采用线性升温的公式计算挥发油各组分的KI值，KI＝100n＋100（tx－tn）/（tn＋1－tn），其中tx、tn和tn＋1分别为被分析组分和碳原子数为n和n＋1的正烷烃（tn＜tx＜tn＋1）的流出峰的保留时间［8］。

1.3.4 抑菌试验测定条件

培养基的制备：营养琼脂培养基配方为牛肉膏2.5 g，蛋白胨10.0 g，琼脂粉18.0 g，氯化钠5.0 g，灭菌水1 000 mL，pH 7.2—7.4；改良马丁氏培养基配方为酵母浸出粉2.0 g，蛋白胨5.0 g，琼脂粉18.0 g，硫酸镁0.5 g，磷酸氢二钾1.0 g，葡萄糖20.0 g，灭菌水1 000 mL，pH 6.8［9］。

菌种的活化：超净台紫外灭菌30 min后通风，在酒精灯火焰上将接种环灼烧灭菌，从供试菌斜面上取少量菌苔并接种于培养基。接种藤黄微球菌等10种细菌于备好的琼脂培养基中，30—32℃培养24 h；在改良马丁氏培养基中接种白色念球菌等3种真菌，25—28℃培养2 d。

菌悬液的制备：用3 m L灭菌的0.05%（v/v）聚山梨酯80和80 m L医用无菌生理盐水溶液洗脱孢子，然后用无菌移液枪将孢子悬液转移至无菌试管内，用医用无菌生理盐水将上述细菌制成108cfu/mL。

抑菌圈的测定：移液枪吸取制备好的供试菌悬液200μL，加入到200 mL已灭菌的细菌或真菌培养基中，混匀。按标号顺序依次倒入培养皿中，待凝固。将直径为6 mm的圆形纸片放入洁净且干燥的平板内，121℃高压灭菌15 min。用滤纸片浸取3个不同浓度的蓝侧金盏花挥发油，平放在已凝固的培养基上，平行做3组试验。空白对照为无菌水，阳性对照为氯霉素。细菌35—37℃培养24 h，真菌23—28℃培养2 d。

MIC（最小抑菌浓度）测定：用二甲基亚砜作溶剂配制蓝侧金盏花挥发油的6个浓度梯度0.500μL/μL、0.333μL/μL、0.167μL/μL、0.125μL/μL、0.083μL/μL、0.042μL/μL，从而确定其最小抑菌浓度。空白对照为无菌水，阳性对照为氯霉素。

2 结果与分析

2.1 水蒸气蒸馏法萃取

在上述萃取条件下，得到黄绿色油液。挥发油提取率为1.25 mL/（100 g）。

2.2 GC-MS分析结果

按上述GC-MS条件分析蓝侧金盏花挥发油，利用峰面积归一化法计算相对含量，鉴定相对峰面积大于0.01%的组分的化学结构；并对各峰的质谱图进行NIST标准谱库检索，计算其KI值（表2）。

表2 蓝侧金盏花的挥发油化学成分分析结果Table 2 Analysis results of the volatile oil chem ical constituents of Adonis coerulea M axim

（续表2）

通过对蓝侧金盏花挥发油的GC-MS分析，共分离鉴定出匹配度在85%以上且相对含量大于0.01%的化学成分34种，以单萜烃化合物（32.46%）和倍半萜类化合物（17.22%）为主。烯类有13种，占3398%，如蒈烯（9.70%）、α蒎烯（5.70%）；酯类10种，占13.50%，如反-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇乙酸酯（395%）；醇类5种，占12.19%，如红没药醇（4.82%）；此外还有烃类、酮类、醚类等化合物。

2.3 抗菌试验结果

如表3所示，蓝侧金盏花挥发油除了对蜡样芽孢杆菌和3种受试真菌无抑制作用外，对7种革兰氏阴性菌和1种革兰氏阳性菌都表现出了抑制作用；对藤黄微球菌、乙型副伤寒沙门菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌等均表现出较强的抑制作用；蓝侧金盏花挥发油对真菌无抑制作用，对革兰氏阴性菌抑制效果较革兰氏阳性菌强。

表3 不同浓度蓝侧金盏花挥发油抑菌圈结果Table 3 Inhibition zone results of different concentrations of volatile oil of Adonis coerulea M axim mm

通过测定最低抑菌浓度MIC得知，蓝侧金盏花的挥发油在一定的浓度范围内才具有较好的抑菌作用，对不同的待测菌种有不同的最低抑制浓度；藤黄微球菌和肺炎克雷伯菌的最低抑制浓度为0.125μL/μL、大肠埃希菌的最低抑制浓度为0.333μL/μL，其他5个菌种的最低抑制浓度为0.167μL/μL（表4）。

表4 蓝侧金盏花挥发油最低抑菌浓度M IC结果Table 4 M inim um inhibitory concentration results of volatile oil of Adonis coerulea M axim mm

3 结论与讨论

3.1 通过对挥发油的GC-MS分析，共分离鉴定出34种成分，以单萜烃和倍半萜类为主。烯类有13种，酯类有10种，醇类有5种，此外还有烃类、酮类、醚类等化合物。

3.2 蓝侧金盏花挥发油对7种革兰氏阴性菌和1种革兰氏阳性菌都表现出了抑制作用；对藤黄微球菌、乙型副伤寒沙门菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌等均表现出较强的抑制作用；蓝侧金盏花挥发油对真菌无抑制作用，对革兰氏阴性菌抑制效果较革兰氏阳性菌强。

3.3 蓝侧金盏花挥发油中，萜烯类物质和醇酯类物质是主要的抑菌有效成分。另外，酮类、醚类和烃类物质也具有一定的抑菌活性。因此，蓝侧金盏花挥发油的抑菌活性可能是各成分抑菌效果的叠加。蒈烯（9.7%）对蓝侧金盏花挥发油抑菌作用有贡献；α蒎烯（5.7%）对本试验筛选出的8种供试菌种均有较好的抑制作用［10］。红没药醇（4.82%）具有抗炎、抑菌活性；桉油烯醇（1.59%）对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌有较好的抑制作用；乙酸龙脑酯（0.76%）有镇痛抗炎作用［11］；吉马烯（2.39%）还有一定的抗肿瘤作用［12］。

3.4 本试验通过分析鉴定藏药蓝侧金盏花挥发油的主要化学成分，以及研究其抑菌活性，为藏药蓝侧金盏花的进一步研究及开发利用提供了依据，并为该植物的成分研究和蓝侧金盏花指纹图谱的研究奠定了基础。

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（责任编辑：闫其涛）

Analysis of the volatile oil constituents and their antibacterial activity of Adonis coerulea M axim

QIAN Shuai1，2，3，BAO Ting-wen1，3，NAN Jie-dong-zhi1，2，LU Yong-chang1，2，3，LIHai-li1，2，3
（1College of Pharmacy，Qinghai Nationalities University，Xining 810007，China；2Qinghai Tibetan Plateau Key Laboratory of Plant Resource Chemistry，Xining 810007，China；3Qinghai Key Laboratory of Pharmaceutical Analysis，Xining 810007，China）

The volatile oil of Adonis coerulea Maxim was extracted by steam distillation and analyzed by GC-MS.The antibacterial activity of the volatile oilwas studied by filter paper diffusion method.The results showed that there were 34 chemical constituents with over 85%matching degree of Adonis coerulea Maxim by GC-MS，which accounted for 64.17%of relative content of total ion peak，and the main compositions included carene（970%），alpha-pinene（5.70%）and alpha-bisabolol（4.82%）.The volatile oil of Adonis coerulea Maxim had good inhibitory activity on 7 kinds of gram-negative bacteria and 1 gram-positive bacteria，and had no inhibitory effect on the 3 tested fungi.

Adonis coerulea Maxim；Volatile oil；GC-MS；Antibacterial activity

S567

：A

1000-3924（2017）02-109-05

10.15955j.issn1000-3924.2017.02.20

2016-06-23

钱帅（1991—），男，在读硕士，研究方向为中藏药物分析。E-mail：1073636068＠qq.com，Tel：18997296365

卢永昌（1965—），男，本科，教授，主要从事藏药的研究与开发。E-mail：qhlyc＠126.com