鸡汤中一株耐热菌的分离与鉴定

骆琦，李娜，李楠，赵芳，刘常金

（天津科技大学，天津300457）

鸡汤中一株耐热菌的分离与鉴定

骆琦，李娜，李楠，赵芳，刘常金*

（天津科技大学，天津300457）

实验室自制肉制品（鸡肉汤）中分离得到一株耐热菌，进行菌落形态、生理生化特征鉴定，并采用Biolog快速鉴定结合16S r DNA序列分析两种方式鉴定，16S r DNA序列分析结果表明此菌株属于芽孢杆菌属，Biolog快速鉴定结果显示此菌株属于芽孢杆菌属中的枯草芽孢杆菌。因此导致鸡汤高温加热后仍腐败变质的菌株为枯草芽孢杆菌。

芽孢杆菌；16S r DNA鉴定；Biolog

食品的腐败变质是影响食品安全问题的重要因素，而微生物的繁殖又是食品腐败变质的主要原因。尤其是鱼、肉、乳等高蛋白食品，在腐败微生物及微生物所分泌酶的作用下，复杂的高分子物质逐渐分解为低分子物质，改变原来的色泽及形态，并产生异常气味，同时产生有毒物质，进而损害人体健康。

我国有“宁可食无肉，不可饭无汤”的说法。鸡汤是消费者青睐的滋补佳品，其中的短肽、氨基酸、胶质物质、维生素等营养成分容易被人体消化吸收[1]。随着生活节奏的加快，商品化鸡汤有着广阔的发展空间。目前关于鸡汤商品化生产及其品质特征的研究还不多，鸡汤产业链的保藏技术不够完善。本试验从鸡汤中腐败微生物入手，将分离得到的一株耐热菌株进行鉴定，以便进行杀菌手段的研究，对鸡汤的商品化有着重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡汤：食品学院农产品物流保鲜与加工实验室自制，105℃高温加热20 min，然后80℃保温30 min[2]。

1.2 主要试剂

Biolog培养基、96孔ECO板：美国Biolog公司；革兰氏染色液、孔雀绿染液、牛肉膏蛋白胨培养基：天津化学试剂一厂；测序试剂：Miseq PE250：美国Illumina公司；DNA提取：QIAamp Fast stool DNA kit：德国QIAGEN公司；捕获磁珠 ：AmpureBeads：美国Beckman公司；Qubit定量：Quant-iTTMPicoGreendsDNA Assay Kit：美国Life公司；纯水及其它生化试剂。

1.3 设备与材料

电热恒温培养箱：常州普天仪器制造有限公司；高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；H-3微型旋涡混合仪：美国SI公司；Miseq高通量测序仪：美国Illumina公司；冷冻离心机：美国Scan speed公司；MD酶标仪：美国MD公司；电泳仪：中国天能公司；凝胶成像系统：中国天能公司。

1.4 试验方法

1.4.1 耐热菌的分离

取鸡汤在36℃生化培养箱中培养5 d，取腐败肉汤5 mL于85℃水浴休克15 min后做梯度稀释，将适合浓度涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上，37℃培养48 h。挑取生长快单菌落划线分离，挑取单菌落。分离纯化后的菌株制成107cfu/mL的菌悬液，90℃热休克处理30min后涂布在牛肉膏蛋白胨平板上，37℃培养24h[3]。对经过耐热筛选后的菌株进行菌落形态，生理生化的初步鉴定，于－20℃保存。

1.4.2 形态及生理鉴定

1.4.2.1 生理生化测定

用革兰氏染色法、芽孢染色法、扫描电镜等方法观察菌体形态特征。

接触酶试验、氧化酶试验、明胶液化、VP实验、淀粉水解、吲哚试验，根据《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》进行鉴定[4]。

1.4.2.2 Biolog生理鉴定

1）BUG培养基的配制：称取5.7 gBUG培养基，定容至90 mL，煮沸溶解，冷却至25℃后调整pH值至7.3±0.1，121℃下灭菌20 min，冷却至45℃后加入10 mL已灭菌的麦芽糖溶液，浓度为2.5%，混匀，冷却后倒平板。

2）巯基乙酸钠8滴+3 mL蒸馏水，用棉签涂在平板上[5]。

3）晾干后，十字交叉的方法轻轻涂菌，30℃培养10 h。

在BUG+M+T培养基中进行扩大培养，然后接种到Biolog专用接种液中制备成均一的菌悬液，转接到微孔板上进行培养，在培养4 h～6 h和16 h～24 h时在读数仪上读取菌株的代谢指纹特征，在Biolog数据库中进行相似性比对，查找最接近的结果[6－7]。

1.4.3 16S r DNA鉴定

1.4.3.1 DNA抽提

参照DNA提取试剂盒说明方法进行DNA提取。

1.4.3.2 DNA质检

1）取1 μLDNA提取物，MD酶标仪定量；

2）根据定量结果，取50 ng 1%琼脂糖电泳检测。

1.4.3.3 16s文库构建流程

1）PCR第一轮扩增

PCR扩增程序如下：94℃，3 min；20循环（94℃，10 s；55℃，15 s；72℃，30 s），72℃ 7min，10℃保温。

2）PCR产物纯化

样品与磁珠1∶1（各22 μL）充分混匀，室温放置10 min；然后静置于磁力架上，加200 μL 80%乙醇，30 s后去上清，重复洗涤一次；将样品置于室温晾干，加22 μL的ddH2O充分悬浮，室温放置5 min后置于磁力架上至完全分离，取20 μL上清进行Qubit定量；进一步将纯化产物进行第二轮PCR及纯化[8]。

1.4.3.4 生物信息学分析

根据MiSeq测序数据的低质量分数集中于末端的分布特点，首先对原始数据进行质量控制，利用Trimmomatic软件进行去杂，获得最终用于分析的优化序列，利用uparse软件以16S rRNA基因序列进行操作分类单元（OTU）聚类，总结相似度大于等于97%的OTU中序列几乎归类于同一个属[9]。

2 结果与讨论

2.1 形态及生理生化鉴定结果

通过分离、筛选及纯化，得到了1株经85℃、30min水浴后长势良好的菌株LQ－1。LQ－1革兰氏染色呈阳性；菌体杆状或椭球状；在牛肉膏培养基上菌落白色或微黄色，边缘放射状，成熟菌落有火山状褶皱，直径约4 mm～6 mm，生长较快。表1为生理生化鉴定结果。LQ－1的形态见图1。

表1 LQ-1生理生化鉴定Table 1 Biochemical and physiological characteristics of LQ-1

图1 LQ-1的形态Fig.1 The morphology of LQ-1

结合该菌的生理生化特征及菌落形态，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》，可初步鉴定出LQ－1属于芽孢杆菌属中的枯草芽孢杆菌。

2.2 Biolog鉴定

根据菌株的生理生化特性，将菌分别接种到BUG+M+T培养基上，16 h后用棉签将菌落沾起，分散到GN/GP－IF专用接种液中，制备成均一的菌悬液，调整浊度到（52±2）%，接种到GN鉴定板上，接种量150 L，30℃培养。对菌株在鉴定板上培养4 h～6 h和16 h～24 h的结果读取数据，鉴定结果见表2。

表2 Biolog鉴定结果Table 2 The result of Biolog identification

根据LQ－1的代谢指数，经过Biolog鉴定分析，在4 h～6 h，该菌与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的SIM比较高，分别为0.57和0.29，16 h～24 h读数显示，与枯草芽孢杆菌相似性为0.61。图2给出了Biolog96孔板鉴定16 h～24 h代谢指纹特征图。

图2 菌株的指纹代谢特征图Fig.2 The metabolic characteristics of cultures

2.3 16S r DNA测序分析

高通量测序结果显示，从样本中获得197 92条高质量16S r DNA序列，平均长度465.6 bp，连接后的序列长度分布图见图3。

图3 接后的序列长度分布图Fig.3 Lenth distribution

表3 LQ-1 16S r DNA鉴定结果Table 3 The result of 16S r DNA analysis

经同源性分析发现，LQ－1属于芽孢杆菌属，同源性达97%以上。结合以上生理生化鉴定结果，推测该菌为枯草芽孢杆菌。

3 结论与讨论

本研究对从鸡汤分离出的耐热产芽孢菌通过形态学观察、生理生化特征分析、16S r DNA序列分析推测其为枯草芽孢杆菌。Biolog系统规定：细菌培养4 h～6 h其SIM≥0.75，培养16 h～24 h SIM≥0.5，系统自动给出鉴定结果为种名，当SIM＜0.75（4 h～6 h）或0.5（16 h～24 h），自动给出的鉴定结果为属名。Biolog快速鉴定与分子生物学的鉴定结果一致且鉴定时间只需要2 d。

国内对鲜肉、高温肉制品微生物的研究较多，主要是好氧性微生物以及乳酸菌、芽孢杆菌和酵母等[10]；国外对低温肉制品研究较多，主要有假单胞菌、肠杆菌、乳酸菌[6]、致病菌株单增李斯特氏菌[11]、梭菌属[12]、肉杆菌属[13]、沙门氏菌属[14]等，其中芽孢杆菌、梭菌属、肉杆菌属中的菌种能产生芽孢。由于芽孢含水量低（40%）、含有耐热小分子酶类、富含大量特殊的吡啶二羧酸钙和待用二硫键的蛋白质以及具有多层次厚而致密的芽孢壁等原因，较营养体呈现出较强的抗性，故一般加热法不能将其杀死，外界刺激比如加热可能促使其萌发成营养细胞，导致食品腐败变质。产芽孢细菌致死的温度通常在100℃～130℃之间，此温度可显著破坏鸡汤中的营养成分和呈味物质。因此，低温肉制品逐渐成为我国肉制品发展的趋势，但是，由于低温肉制品加工的中心温度在68℃～72℃之间，一些芽孢杆菌会存活下来，产品易产生涨袋、出油等变质现象，需进一步研究。

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Isolation and Identification of One Heat-resisting Strains in Chicken Soup

LUO Qi，LI Na，LI Nan，ZHAO Fang，LIU Chang-jin*
（Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

One heat-resisting strains，isolated by our lab-made meat product（chicken soup），was identified by colony morphology，physiological and biochemical characteristics，16S r DNA sequence analysis and Biolog Microstation System.The results from 16S r DNA sequence analysis shown that strains LQ-1 was belong to Bacillus genus.It indicated that it was belong to Bacillus subtilis spores with Biolog Microstation System. Therefore it is the Bacillus subtilis spores that resulted in the putrescence after chicken soup exposed to superheat for more than 10 minutes.

Bacillus；16S r DNA；Biolog

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.039

2016－08－18

骆琦（1991—），女（汉），在读硕士，研究方向：农产品加工及贮藏。

*通信作者：刘常金（1969—），男，硕士生导师，博士，研究方向：农副产品生物转化及资源开发。