葡萄籽、松树皮和花生衣提取物中原花青素成分研究

杨清山，张燕，连运河，高伟，周丽

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2.晨光生物科技集团股份有限公司，河北邯郸057250）

葡萄籽、松树皮和花生衣提取物中原花青素成分研究

杨清山1，2，张燕1，连运河2，高伟2，周丽2

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2.晨光生物科技集团股份有限公司，河北邯郸057250）

建立葡萄籽提取物中7种原花青素成分的高效液相色谱测定方法。以该方法对不同品种的葡萄籽、松树皮和花生衣提取物进行测定分析。结果表明：葡萄籽、松树皮和花生衣提取物中的原花青素成分种类和含量水平差异较大。不同品种的葡萄籽提取物中原花青素成分种类水平一致，不同品种的花生衣提取物中原花青素成分种类水平也一致，而不同品种的松树皮提取物中原花青素成分种类差距较大。该方法可以用于简单快速地区分葡萄籽提取物、松树皮提取物和花生衣提取物。

葡萄籽；松树皮；花生衣；原花青素

原花色素是一大类多酚化合物的总称，其主要有黄烷醇单体及其聚合体组成，该化合物的共同点均是能够在酸性条件下加热分解产生花青素（cyanidins），故将这类多酚化合物命名为原花青素（Proanthocyanidins，简称PC）[1]。原花青素在葡萄籽和皮、松树皮、花生衣、山楂果、刺葵、银杏叶、荔枝和草莓中广泛存在[2-7]，但目前研究最多的来源是葡萄籽和葡萄皮中的原花青素[8]。原花青素是由儿茶素或表儿茶素单体按照不同的方式和数量缩合而成，最简单的原花青素二聚体是由儿茶素或表儿茶素自身缩合，或者由进行缩合，此外单体间还可以再形成三聚体、四聚体、五聚体等直至更多聚体[9]。原花青素具有较高的生理和药理活性，包括抗氧化、保护心血管和调节免疫活性等，此外还有具有抑制酶活性、抗病毒、抗真菌活性、抗溃疡、促进毛发生长、保护皮肤、保护肝脏、抗腹泻活性、抗致突变作用和抗抑郁等功效[10]。

松树皮和花生衣作为原花青素的重要来源，其提取物具有相似的结构，同样也具备一定的生理和药理活性，但其功效远不及葡萄籽提取物[11-12]。由于松树皮和花生衣提取物的生产成本较低，近些年来一些不法商贩在葡萄籽提取物中以掺入或者以直接代替的方式，以次充好来获取利益，严重扰乱了葡萄籽提取物的市场。本文建立了一种能够同时测定葡萄籽提取物中7种原花青素的高效液相色谱方法，并对不同品种的葡萄籽、松树皮和花生衣提取物进行检测分析。通过对比不同来源提取物中原花青素各个组分及含量情况，可以简单快速的区分这3类提取物。该方法为规范葡萄籽提取物市场及真伪鉴别提供了技术手段。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

Agilent 1260液相色谱仪，配四元泵和紫外检测器：美国安捷伦科技有限公司；JJ300电子天平：常熟市双杰测试仪器厂；AUW220D电子天平：河北汇博云海科技发展有限公司；DK-S24电子恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；R213B旋转蒸发仪：上海申生科技有限公司；FW100高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；101-0N电热鼓风干燥箱：天津华北试验仪器有限公司；TG16-WS台式高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；TH-300BQ数控超声清洗器：济宁天华超声电子仪器有限公司。

没食子酸（纯度89.9%）：购自中国食品药品检定研究院；原花青素B1（纯度95%）、原花青素B2（纯度98%）、EGCG（表没食子儿茶素没食子酸酯）（纯度98%）、ECG（表儿茶素没食子酸酯）（纯度99%）：购自天津一方科技有限公司；儿茶素（纯度98%）：购自上海源叶生物科技有限公司；表儿茶素（纯度98%）：购自中国药品生物制品鉴定所。

乙腈、甲醇（色谱纯）：购自安徽时联特种溶剂股份有限公司；乙醇、磷酸（分析纯）：购自天津市光复科技发展有限公司。

葡萄籽（7种）：法国、新疆、河北昌黎、山东、甘肃莫高、新疆白葡萄和西部牧业，均从市场购买；松树皮（7种）：樟子松、落叶松、马尾松、红松、外国松、沐阳样品和杭州样品，均从市场购买；花生（9种）：黑花生8#、鲁花11#、豫花C-3000、花育22、四粒红、小白沙、丰花1#、山东样品和亳州样品，均从市场购买。

树脂：大孔吸附树脂（型号LXA-8），由西安蓝晓科技有限公司提供。

1.2 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6×150 mm，5 μm）；波长：278 nm；色谱柱温度：40℃；进样量：5 μL；运行时间：29 min；流速：1.2 mL/min。

流动相：乙腈（A）-0.3%磷酸水（B）。梯度条件：0 min：10%A；15 min：18%A；23 min：60%A；24 min：10%A；29 min：10%A。

1.3 标准品溶液的配制

1.3.1 标准储备液

分别准确称取没食子酸、原花青素B1、儿茶素、原花青素B2、表儿茶素、EGCG（表没食子儿茶素没食子酸酯）和ECG（表儿茶素没食子酸酯）对照品10 mg左右，置于同一个25 mL棕色容量瓶中，用色谱级甲醇定容，超声溶解，摇匀，转移至专用标准液瓶中，作为储备液，浓度为0.4 mg/mL。

1.3.2 标准工作液

将储备液做2倍梯度稀释，得到5个浓度水平的工作液，分别为0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL，做标准曲线，确定线性范围。移取5 mL储备溶液至于25 mL棕色容量瓶中，用色谱级甲醇定容，摇匀，转移至专用标准液瓶中，作为工作液，浓度为0.08 mg/mL。

1.4 样品溶液的制备

1.4.1 样品预处理

1）葡萄籽：用万能粉碎机将样品粉碎，粉碎细度为20目通过率80%以上。最后将葡萄籽粉混合均匀，备用。

2）松树皮：将样品用剪刀剪成1 cm左右小块，置于40℃干燥箱中进行干燥处理。最终烘至水分在15%以下，然后用万能粉碎机进行粉碎，粉碎细度为20目通过率80%以上。最后将松树皮粉混合均匀，备用。

3）花生：先将花生进行去壳处理，再将花生果实置于40℃干燥箱中进行干燥处理。烘至可以脱皮为止。用手进行揉搓脱皮处理，将脱下的皮（花生衣）用万能粉碎机进行粉碎，粉碎细度为20目通过率80%以上。最后将花生衣粉混合均匀，备用。

1.4.2 提取物制备

1）萃取：取1.4.1制备好的各个样品150 g，用纱布包好后置于1 000 mL烧杯中，用含有0.5 g/100 mL磷酸的50%乙醇（体积分数）溶液进行萃取。萃取温度65℃，萃取3遍，萃取溶剂料液比分别为1∶5、1∶3和1∶2（g/mL），时间分别为3、2、1 h，合并萃取液。

2）纯化：将萃取液浓缩至干，加入2.5 L纯净水溶解，冷却至室温，离心（4 000 r/min，10 min），取离心上清液上大孔吸附树脂柱（LXA-8）进行吸附，流速1 BV/h。使用0.5 L纯净水清洗，流速1.5 BV/h～2 BV/h。最后用0.5 L70%乙醇（体积分数）溶剂进行解吸，流速1 BV/h。

3）干燥：将收集的解吸液用旋转蒸发仪浓缩至水分5%以下，得到提取物粗品，再将粗品研磨成粉末，细度为60目通过率90%以上，得到各个样品的提取物成品，待分析测试用。

1.4.3 供试样品液制备

称取0.100 0 g左右样品，用50%乙醇稀释定容至10 mL容量瓶中，超声溶解，摇匀，恢复至室温，过0.45 μm滤膜，待测。

2 结果与分析

2.1 液相色谱条件优化

2.1.1 色谱柱选择

根据原花青素成分的特点，结合文献方法信息，保存能力较强的反相色谱柱（C18）能够满足使用要求。不同品牌、型号、粒径和长度的色谱柱，对原花青素的保留能力和分离能力也不同。通过对实验室现有的色谱柱资源进行筛选和试验分离，最终确定色谱柱的规格型号为：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6× 150 mm，5 μm）。

2.1.2 进样量优化

进样量太大会在色谱柱中产生溶剂效应，造成色谱峰分离效果和峰形变差；进样量太小会造成仪器检测的稳定性变差，且灵敏度也会变低。通过调整不同的进样量进行试验验证，最终确定进样量参数为：5 μL。

2.1.3 其他条件优化

参考的葡萄籽提取物中儿茶素和表儿茶素检测方法运行时间达到90 min，不能够满足大量样品的快速检测。通过对流速、柱温、流动相成分及梯度条件进行调整，最终确定各项参数条件为：流速1.2 mL/min；柱温40℃；流动相乙腈（A）-0.3%磷酸水（B）；梯度条件0 min（10%A），15 min（18%A），23 min（60%A），24 min（10%A），29 min（10%A）。该条件能够实现葡萄籽中各种原花青素在30 min内实现分离。

2.2 色谱图及保留时间

按照优化后液相条件，分别检测标准工作液和葡萄籽提取物样品，得到色谱图和保留时间见图1和表1。

2.3 标准曲线和检出限

按照试验方案操作方式，将标样依次做梯度稀释配制成标准曲线溶液，按照确定的色谱条件进样检测。采用外标法，以峰面积为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，得到7种原花青素成分的回归方程和相关系数。按照S/N=3确定各种成分的检出限。试验结论如下：

图1 标准品HPLC色谱图Fig.1 The HPLC chromotogram of standards

表1 标准品保留时间Table 1 The retention time of standards

标准曲线及线性范围：没食子酸的标准曲线为y= 13 558x-7.338，R2=1.000 0，在0.011 mg/mL～0.183 mg/mL范围内，对照品质量浓度与峰面积呈良好线性关系；原花青素B1的标准曲线为y=3 142.4x-0.588，R2= 1.000 0，在0.003 mg/mL～0.051 mg/mL范围内，对照品质量浓度与峰面积呈良好线性关系；儿茶素的标准曲线为y=3 250.7x-1.071，R2=1.000 0，在0.008 mg/mL～0.125 mg/mL范围内，对照品质量浓度与峰面积呈良好线性关系；原花青素B2的标准曲线为y=3 097.0x-0.738，R2=1.000 0，在0.004 mg/mL～0.061 mg/mL范围内，对照品质量浓度与峰面积呈良好线性关系；表儿茶素的标准曲线为y=3 219.0x-2.371，R2=1.000 0，在0.017 mg/mL～0.278 mg/mL范围内，对照品质量浓度与峰面积呈良好线性关系；表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的标准曲线为y=5 987.2x-5.454，R2=1.000 0，在0.012 mg/mL～0.186 mg/mL范围内，对照品质量浓度与峰面积呈良好线性关系；表儿茶素没食子酸酯（ECG）的标准曲线为y=8 257.6x-8.463，R2=1.000 0，在0.020 mg/mL～0.317 mg/mL范围内，对照品质量浓度与峰面积呈良好线性关系。

检出限：没食子酸0.04mg/L；原花青素B10.28mg/L；儿茶素0.28 mg/L；原花青素B2 0.28 mg/L；表儿茶素0.36 mg/L；表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）0.33 mg/L；表儿茶素没食子酸酯（ECG）0.17 mg/L。

2.4 精密度验证

将同一瓶标准工作液重复进样检测6次，计算其峰面积的RSD，验证检测的精密度情况。试验结果表明标样检测精密度良好，RSD均在1%以内，试验数据见表2。

表2 标样检测精密度试验Table 2 The precision test of standards

2.5 回收率验证

选择已知浓度的样品液，分别添加3个不同浓度水平的标准混合工作液，做加标回收率验证试验，验证检测的准确性。回收率/%=测得值/（原有值+加标值）×100试验表明，加标回收率均在在85%～110%之间，平均回收率为99.02%，检测准确性良好。试验数据见表3。

表3 样品加标回收率试验数据Table 3 The recovery test of samples

2.6 精密度验证

按照确定的样品处理方法，选择4份葡萄籽提取物样品，分别做日间检测重复性试验，验证检测结果的精密度。验证结果为：葡萄籽提取物中各个原花青素检测的RSD均在5%以内，符合分析方法要求。试验数据见表4。

表4 样品检测精密度试验Table 4 The precision test of samples

2.7 葡萄籽、松树皮和花生衣提取物样品检测结果

将1.4.2制备的各个提取物样品按照1.4.3制备出供试样品液，按照1.2仪器条件进行检测，得到各个提取物中的7种有效成分检测结果见表5、表6和表7。

表5 葡萄籽提取物中7种成分检测结果Table 5 The test of seven components in grape extract

表6 松树皮提取物中7种成分检测结果Table 6 The test of seven components in pine bark extract

表7 花生衣提取物中7种成分检测结果Table 7 The test of seven components in peanut coat extract

结果分析：不同品种葡萄籽提取物中的原花青素种类较一致，但含量水平有所差异，其中原花青素B1、儿茶素、原花青素B2和表儿茶素的含量相比较高，平均超出1%含量水平；不同品种松树皮提取物中的原花青素种类和含量水平均差异较大，其中原花青素B1、儿茶素和表儿茶素没食子酸酯（ECG）的含量相比较高，个别品种的特定成分含量超出了1%水平；不同品种花生衣提取物中的原花青素种类较一致，但含量水平也有所差异，其中儿茶素、原花青素B2和表儿茶素的含量相比较高，除黑花生8#和鲁花11#外均超出了1%含量水平。

从整体来看，不同类型提取物中的各个成分含量存在明显差异，同一类型不同品种的葡萄籽、花生衣、松树皮提取物中各成分含量也存在部分差异。花生衣和松树皮提取物中几乎没有没食子酸成分，且原花青素B1、儿茶素和原花青素B2含量明显低于葡萄籽提取物，松树皮提取物中表儿茶素没食子酸酯（ECG）含量高于葡萄籽和花生衣提取物。

3 结论

本试验确定了一种简单、快速并能准确测定葡萄籽提取物中7种原花青素的高效液相色谱方法，能够为葡萄籽提取物的质量评价方式提供技术支持。一方面可以通过总含量的高低，判断产品质量的高低；另一方面可以从各个分成分含量水平的高低，评价差异化的产品特性。以此方法分别对不同品种的葡萄籽、松树皮和花生衣提取物中的原花青素进行检测，通过对比原花青素的种类和含量高低，可以区分这3类原花青素，以此可以鉴别这3类原花青素。该方法只能从已知的7种原花青素的定性和定量结果进行鉴别分析，对于如何从松树皮提取物或花生衣提取物中找到其特有的成分进行分析，以实现更简单和更准确的鉴别，需要其他学者做进一步研究。

[1] 张小军,夏春镗,吴建铭,等.原花青素的资源研究[J].中药材, 2009,32(7):1154-1160

[2]单静敏,曹雁平,肖俊松,等.葡萄籽和苹果原花青素对变形链球菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用[J].食品科学,2011(17):123-127

[3]杜蕾,李新华.黑、红花生衣中原花色素的分析[J].食品科学,2014 (4):190-194

[4] 徐璐,郑建仙.松树皮提取物的研究进展[J].食品工业,2005(4): 36-38

[5]涂佳,邓学良,周文化,等.野生毛葡萄常规营养成分和原花青素含量分析[J].食品与机械,2010,26(2):82-85

[6]张泽生,高薇薇,张颖,等.山楂果原花青素稳定性研究[J].食品工业科技,2010,31(8):108-112

[7]陈红惠,沈清清.草莓中原花青素提取工艺研究[J].文山师范高等专科学校学报,2013,26(3):1-4

[8]张冰若,劳业兴,苏薇薇,等.原花青素的研究现状及开发前景[J].中药材,2003,26(12):905-908

[9]张迪,赵文军,马丽娟,等.原花青素的性质、功能、纯化和利用[J].安徽农学通报,2009,15(1):35-39

[10]张妍,吴秀香.原花青素研究进展[J].中药药理与临床,2011(6): 112-116

[11]赵艳敏,王志平,刘岱琳,等.葡萄籽和花生红衣中原花青素的差异性研究[J].食品研究与开发,2014(3):75-78,84

[12]李美娟,劳乔聪,姜永新,等.几种植物原花青素及其片段化产物的抗ROS活性评价[J].云南林业科技,2014(1):99-103

Research of Procyanidins in Grape Seed，Pine Bark and Peanut Coat Extract

YANG Qing-shan1，2，ZHANG Yan1，LIAN Yun-he2，GAO Wei2，ZHOU Li2
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.Chenguang Biotech Group Co.，Ltd.，Handan 057250，Hebei，China）

A high performance liquid chromatographic method was established for determining 7 kinds of procyanidins component in grape seed extract.Based on this method，different varieties of grape seed extract，pine bark and peanuts coat extract were analyzed.The results showed that：there was great difference in procyanidins omponent types and levels among grape seed extract，pine bark and peanuts coat extract.Different varieties of grape seed extract had similar procyanidins component types，and different varieties of peanuts coat extract had similar procyanidins component types too.But different varieties of pine bark extract had different procyanidins component types.Due to this method，it can be distinguished grape seed extract，pine bark and peanuts coat extract easily and quickly.

grape seed；pine bark；peanut coat；procyanidins

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.037

2016-08-16

杨清山（1985—），男（汉），工程师，学士，研究方向：食品分析和检测。