响应面法优化木薯叶中黄酮类化合物的浸提条件

雍梁敏，刘畅，刘石生，*

（1.三亚学院，海南三亚572022；2.海南大学食品学院，海南海口570228）

响应面法优化木薯叶中黄酮类化合物的浸提条件

雍梁敏1，2，刘畅2，刘石生2，*

（1.三亚学院，海南三亚572022；2.海南大学食品学院，海南海口570228）

采用碳酸氢钠浸提木薯叶中黄酮类化合物，并用NaNO2-Al（NO3）3比色法测定黄酮类化合物的含量。通过Box-Benhnken试验设计及响应面分析法对影响木薯叶浸提黄酮类化合物的主要因素进行条件优化。结果表明最优条件为：加水量30.77 mL/g，浸提温度79.65℃，浸提时间11.82 min，NaHCO3添加量0.03 g。在此工艺条件下浸提得到的黄酮类化合物含量为1 172.17 mg/100 g。

木薯叶；黄酮类化合物；碳酸氢钠；响应面

木薯（Manihot esculenta Crantz）又叫做树薯、木番薯，地下部结薯，属热带亚热带根茎作物，原产于亚马逊河流域，是世界三大薯类（马铃薯、番薯、木薯）之一[1-2]。在我国，木薯广泛栽培于广西、海南、广东、云南、福建、台湾等省区[3]。目前，种植木薯主要是为了获取其块根，用来生产淀粉和酒精[4]，在国内一般用作饲料，其价值没有得到充分的重视。在亚马逊丛林地区生活的印第安人传统上把木薯叶作为一种草药，烘干磨碎后制成叶粉，与其他草药配合使用来治疗某些疾病，疗效显著[5]。木薯叶中含有丰富黄酮类化合物，黄酮类化合物是一类具有多种保健功能的化合物，具有消除氧自由基、调节血脂、抗肿瘤、抗病毒等生理活性[6]。

Isao Kubo等研究了巴西的木薯品种maniva木薯叶中黄酮类化合物，用95%乙醇提取分析：100 g叶片含槲皮素84 mg、4，5，7-三羟黄酮醇84 mg、芦丁462mg[4]。木薯叶中主要含有的黄酮类化合物为芦丁，其属维生素类药，有降低毛细血管通透性和脆性的作用，保持及恢复毛细血管的正常弹性。用于防治高血压脑溢血，糖尿病视网膜出血和出血性紫癜等，也用作食品抗氧剂和色素[7]。以往提取黄酮类化合物都是采用有机溶剂提取法，不利于食用。本文利用碳酸氢钠对木薯叶中的黄酮类化合物进行提取，优选出最优提取条件，以期拓宽木薯叶中黄酮类化合物在食品中的应用。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

华农8号木薯叶：采自中国热带科学院生物所文昌基地（海南），提取前先进行冷冻粉碎等处理；芦丁标准品：上海金穗生物科技有限公司。

723N可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。

1.2 方法

木薯叶中黄酮类成分为多酚化合物，因其结构具有羟基，故可用碱性水或碱性稀醇液来对其中的黄酮类化合物进行提取。本文采用碳酸氢钠浸提木薯叶中黄酮类化合物，亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定黄酮类化合物的含量[8]。

1.3 单因素试验设计

1.3.1 单因素试验设计

采用碳酸氢钠对木薯叶中的黄酮类化合物进行浸提，进行单因素试验。试验设计为：加水量（10、20、30、40、50 mL/g），浸提温度（50、60、70、80、90℃），浸提时间（6、8、10、12、14 min），NaHCO3添加量（0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g）。

1.3.2 响应面试验设计

在单因素试验基础上，利用响应面法（RSA）优化浸提工艺参数。其因素水平设计见表1。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Factors and levels of the response surface tests

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以芦丁为标准样，采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定黄酮类化合物的含量。

配置标准溶液：精密称取25mg芦丁标准于100mL容量瓶中，加热溶解，放冷用60%乙醇定容（0.25 mg/ mL）。分别吸取标准溶液2、4、6、8、10 mL于50 mL容量瓶中，标准液浓度分别为：10、20、30、40、50 μg/mL，分别加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6 min，再加入1 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，放置6 min，再加入10 mL 4%氢氧化钠溶液，摇匀，放置15 min，60%乙醇定容在510 nm处比色，所得吸光度浓度曲线及回归方程。得标准曲线，见图1。

图1 标准芦丁吸光度-浓度曲线Fig.1 Standard curve of rutin absorbance-concentration

得出回归方程为：y=0.01x＋0.006 8，R2=0.998 31。

2.2 黄酮类化物浸提的单因素试验

2.2.1 加水量的选择

在温度为80℃，浸提时间为8 min，NaHCO3添加量为0.03 g的条件下，加水量不同，测得黄酮类化合物含量有所差别（图2）。

图2 加水量对黄酮类化合物浸提的影响Fig.2 Effect of water addition on flavonoids extraction

由图2可看出，当加水量为30 mL/g后随着加水量的升高黄酮类化合物含量上升缓慢。说明开始时溶剂量大，溶剂中的有效成分浓度低，与物料及溶剂边界层的有效成分浓度差大，扩散推动力大，因而提取率高，而到30 mL/g后，浓度差减少，提取率降低，考虑成本等因素，最优加水量为30 mL/g左右为宜。

2.2.2 浸提温度的选择

在加水量为30 mL/g，浸提时间为8 min，NaHCO3添加量为0.03 g的条件下，温度不同，测得黄酮类化合物含量有所差别（图3）。

由图3可知，随着温度的升高黄酮类化合物的含量呈先升后降的趋势，在80℃时黄酮类化合物含量达到最大值。因此，浸提的最适温度在80℃左右为宜。

2.2.3 浸提时间的选择

在加水量为30 mL/g，浸提温度为80℃，NaHCO3添加量为0.03 g的条件下，浸提时间不同，测得黄酮类化合物含量有所差别（图4）。

图3 温度对黄酮类化合物浸提的影响Fig.3 Effect of temperature on flavonoids extraction

图4 时间对黄酮化合物浸提的影响Fig.4 Effect of time on flavonoids extraction

由图4可看出，当浸提时间为12 min后，随着时间的延长黄酮类化合物含量上升缓慢。说明提取初期，有效成分浓度差大，提取率增加明显；当达到12 min之后，溶剂中有效成分浓度增大，浓度差变小，随着提取时间的继续延长，提取率基本上不再增加。因此，浸提的时间选择为12 min。

2.2.4 NaHCO3添加量的选择

在加水量为30 mL/g，浸提时间为8 min，温度为80℃的条件下，NaHCO3添加量不同，测得黄酮类化合物含量有所差别（图5）。

图5 NaHCO3添加量对黄酮类化合物浸提的影响Fig.5 Effect of NaHCO3addition on flavonoids extraction

由图5可看出，随着NaHCO3添加量的升高黄酮类化合物的含量呈先升后降的趋势，在NaHCO3添加量为0.03 g时黄酮类化合物含量达到最大值。因此，最佳的NaHCO3添加量为0.03 g。

2.3 响应面法优化试验结果与分析

试验设计及结果见表2，方差分析及显著性比较结果见表3。

表2 响应面试验设计及结果（n=5）Table 2 Designs and results of Box-Benhnken experimental（n=5）

表3 黄酮类化合物含量回归模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression equation

续表3 黄酮类化合物含量回归模型方差分析表Continue table 3 Variance analysis of regression equation

利用Design－expert8.0.6软件对数据进行回归分析，对各因素回归拟合，得到黄酮类化合物含量Y的回归方程Y=1 174.35+12.41A－0.48B－20.88C－9.60D－46.90AB+1.06AC+34.44AD－23.13BC+2.19BD－24.31CD+ 81.33A2－30.36B2－107.22C2－57.19D2。

同时，优化4个影响因素的最佳组合为：加水量为30.77 mL/g，浸提温度79.65℃，浸提时间11.82 min，NaHCO3添加量为0.03 g，预测的黄酮类化合物含量为1 175.96 mg/100 g。

由表3可以看出，所得Y的回归方程极显著，且失拟项不显著，说明此模型很理想，用方程Y拟合4个因素与黄酮类化合物含量是可行的。相关系数R2= 0.998 6，表明回归方程与实际数据间具有较好的拟合性；R2Adj=0.997 2，说明可信度较高。从因素A、B、C、D对黄酮类化合物含量的影响来看，除方程的一次项B影响不显著外，其余因素影响均为极显著。通过比较方程一次项系数绝对值大小，可以判断因素影响的主次性，本试验中因素间影响顺序依次为C＞A＞D＞B；交互项中除AC、BD影响不显著外，其余因素间交互作用对黄酮类化合物含量均达到极显著（P＜0.01）影响，且各具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系，而是呈二次关系。

分别将模型中A、B、C及D其中2个因素固定在0水平，得到另外2个因素间交互作用对黄酮类化合物含量Y的子模型，图6～图9为4个因素间部分两两交互作用对黄酮类化合物含量影响的响应面分析图。

图6 时间和加水量对黄酮类化合物浸提量的影响Fig.6 Effect of time and water addition on flavonoids extraction

图7 碳酸氢钠添加量和加水量对黄酮类化合物浸提量的影响Fig.7 Effect of NaHCO3addition and water addition on flavonoids extraction

图8 温度和碳酸氢钠含量对黄酮类化合物浸提量的影响Fig.8 Effect of temperature and NaHCO3addition on flavonoids extraction

图9 时间和碳酸氢钠添加量对黄酮类化合物浸提量的影响Fig.9 Effect of time and NaHCO3addition on flavonoids extraction

为了检验模型预测的准确性，在最佳浸提条件：加水量为30.77 mL/g，浸提温度为79.65℃，浸提时间为11.82 min，NaHCO3添加量为0.03 g时进行验证性试验，测得黄酮类化合物含量为1 172.17 mg/100 g，与预测值基本接近，表明预测值和真实值间有较好的拟合性，进一步验证了模型的可靠性。

3 结论

以华农8号木薯叶为原料，利用NaHCO3浸提木薯叶中的黄酮类化合物，采用亚硝酸钠－硝酸铝比色法测定黄酮类化合物的含量。在单因素试验结果基础上，利用响应面分析，建立了黄酮类化合物含量与加水量、浸提温度、浸提时间、NaHCO3添加量的二次多项回归模型，其各因素的主要效应关系为：C（浸提时间）＞A（加水量）＞D（NaHCO3添加量）＞B（浸提温度），并确定了最佳浸提条件：加水量为30.77 mL/g，浸提温度79.65℃，浸提时间11.82 min，NaHCO3添加量为0.03 g，此工艺条件下测得平均黄酮类化合物含量为1 172.17 mg/100 g，其与理论值间相对误差为0.323%。

木薯叶中含有很多的植物生物活性物质，是生产天然保健品的主要原料，且价格不菲，市场前景非常广阔。但目前这方面的研究工作做的很少，很多有价值的有效成分未得到充分合理利用。因此采用NaHCO3浸提木薯叶中的黄酮类化合物对于将其用于食品中很有必要。

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Response Surface Methodology for Optimizing Extraction of Flavonoids from Cassava Leaves

YONG Liang-min1，2，LIU Chang2，LIU Shi-sheng2，*
（1.Sanya University，Sanya 572022，Hainan，China；2.College of Food，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

Thispaperusedsodiumbicarbonatetoextractflavonoidsincassavaleaves，thenusedNaNO2-Al（NO3）3colorimetric to determine the content of flavonoids.Response surface methodology was successfully applied for optimization of the extraction condition of flavonoids compounds from cassava leaves.The actually maximum mean light transmittance could reach to 1 172.17 mg/100 g when additive amount of water was 30.77 mL/g，the treatment temperature was 79.65℃，the treatment time was 11.82 min and additive amount of NaHCO3was 0.03 g.

cassava leaves；flavonoids；sodium bicarbonate；response surface

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.014

2016－08－24

雍梁敏（1989—），男（汉），硕士研究生，研究方向：热带农作物研究。

*通信作者：刘石生（1977—），男（汉），教授，博士研究生，研究方向：热带农产品研究。