蜂花粉多糖和黄酮的联合提取及含量测定

张翠香，罗永会，徐春萍，左绍远

（大理大学基础医学院，云南大理671000）

蜂花粉多糖和黄酮的联合提取及含量测定

张翠香，罗永会*，徐春萍，左绍远

（大理大学基础医学院，云南大理671000）

以蜂花粉为原料，用石油醚回流脱去脂类和色素，再用80%乙醇80℃回流2次提取蜂花粉黄酮；滤渣用80℃水提3次后，醇沉后，并用sevag法脱蛋白。计算多糖和黄酮的提取率和纯度，并对试验方法的重复性、精密度和稳定性进行考查。蜂花粉中黄酮的提取率为2.56%（RSD=1.722%，n=5），纯度为82.3%（RSD=2.517%，n=5），多糖提取率为3.11%（RSD=2.826%，n=5），纯度为91.6%（RSD=1.992%，n=5）；精密度试验RSD黄酮=1.760%，RSD多糖= 1.507%，稳定性试验中显色后的90 min内稳定性较好，RSD黄酮=2.947%，RSD多糖=2.632%。

蜂花粉；多糖；黄酮；联合提取

蜂花粉（beepollen）为蜜蜂采集的雄蕊花药的粉状物质，除含有丰富的营养成分外，蜂花粉还含有多糖类、活性肽、黄酮类、核苷类、甾体、醛类、苷类、不饱和脂肪酸及少量生物碱等多种生物活性物质。被称为“完全营养食品”。对人体具有多种保健功能，不仅能增强机体免疫力，而且还可防止动脉硬化、高血脂、高血压、静脉曲张等，是治疗各种疾病的名贵药材[1-3]。

多糖和黄酮都是蜂花粉的主要活性成分。研究表明蜂花粉多糖具有增强机体免疫力、调节血糖、降血脂及抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等多种生物学活性[4-7]，同时，蜂花粉黄酮能够抗氧化和降糖、降脂等生物活性也有所报道[7-10]。目前，蜂花粉中多糖和黄酮类化合物的研究主要集中在提取纯化、含量测定及成分、生物活性等方面。也有很多关于蜂花粉中多糖和黄酮类物质的提取研究的文献。大多数研究都只集中在单一的蜂花粉多糖或黄酮类的提取工艺条件研究上[7-8]，其优点是确定了多糖或黄酮类物质的最佳提取工艺，能充分提取蜂花粉中的多糖或黄酮类物质，获取蜂花中更多的生物活性成分；缺点是单一提取，不能同时获得其中生物活性成分，造成原料和试剂的浪费，耗费时间和能源，造成提取成本的增加等。本研究查阅大量相关文献，参照蜂花粉多糖、黄酮单一提取的最佳工艺，采用联合提取蜂花粉中的黄酮和多糖方法，能从蜂花粉中同时获得蜂花粉重要生物活性物质多糖和黄酮。方法简单易行，可为蜂花粉的进一步开发和研究提供参考，节约时间和成本。

1 材料和仪器

1.1 试剂

芦丁、石油醚（沸程60℃～90℃）、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、浓硫酸、葡萄糖、苯酚等：国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.2 主要仪器

BT-224S型电子分析天平：德国赛多利斯仪器公司；HH－4数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；TDL－4A低速离心机：上海菲恰尔仪器有限公司；722E分光光度计：上海分析仪器有限公司；RA－6000旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DEF-200中药粉碎机：温岭市林大机械有限公司等。

2 方法[11-15]

2.1 蜂花粉多糖和黄酮的提取工艺

2.2 蜂花粉总黄酮的提取

称取1 200 g蜂花粉，用10倍体积的石油醚（沸程30℃～60℃）水浴回流3.0 h，过滤2次，脱去蜂花粉中的脂类，以及色素，滤渣晾干备用。用10倍体积80%乙醇80℃回流2.0 h，过滤，重复2次，合并滤液，减压浓缩回收乙醇，得蜂花粉黄酮浸膏。滤渣晾干即脱脂蜂花粉备用。

2.3 蜂花粉多糖的提取和纯化

取2.2所得脱脂蜂花粉，用8倍体积蒸馏水，80℃振荡水提过夜，过滤，滤液收集置4℃冰箱，滤渣用6倍体积蒸馏水80℃振荡水提2次，每次6.0 h，过滤收集滤液。合并滤液减压浓缩到适当体积，加无水乙醇使终度达90%，置4℃冰箱过夜，离心收集粗多糖沉淀。沉定用蒸馏水溶解得粗多糖溶液，按多糖溶液和sevag脱蛋白液（氯仿∶正丁醇=4∶1）4∶1体积比混合剧烈搅拌30min离心，收集上清液，重复3次，上清液加无水乙醇使终浓度达90%，置4℃冰箱过夜，离心收集沉淀。沉淀分别用无水乙醇，丙酮，乙醚洗涤3次，真空干燥，得灰白色粉状多糖。

2.4 蜂花粉黄酮的含量测定

2.4.1 芦丁标准曲线的绘制

精确称取120℃干燥恒重的芦丁标准品100.0 mg，用50%乙醇定容至100 mL，则芦丁标准液的浓度为1.0 mg/mL，准确吸取对照品溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，置于10 mL刻度试管中，分别加50%乙醇至2.0 mL混匀，加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL混匀，放置6 min，加10%的硝酸铝溶液0.3 mL混匀，放置6 min后加5%的氢氧化钠溶液2.0 mL，混匀，放置15 min加50%乙醇至10.0 mL混匀，以第1管为空白对照，于510 nm处测定吸光度，以芦丁浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

2.4.2 蜂花粉黄酮的含量测定

准确称取2.2所得蜂花粉黄酮浸膏100.0 mg，用50%乙醇定容至100 mL，取2.0 mL，按照2.4.1方法操作，于510 nm处读取吸光度，代入线性回归方程，求出样品液中总黄酮浓度，计算蜂花粉黄酮样品中总黄酮的含量（即总黄酮的纯度）及总黄酮的提取率：

蜂花粉黄酮样品中总黄酮的含量/%=C×V×N×10-6/ M×100

式中：C为样品总黄酮浓度，μg/mL；V为待测样品总体积，mL；M为所称取蜂花粉黄酮的质量，g；N为稀释倍数，10-6，单位换算（1 g=106μg）。

总黄酮提取率/%=提取所得蜂花粉总黄酮的质量/蜂花粉原料质量×100

2.5 蜂花粉多糖的含量测定

2.5.1 葡萄糖标准曲线

精确称取105℃干燥至恒重的葡萄糖100.0 mg，用蒸馏水定容至100 mL，再取该溶液10.0 mL用蒸馏水定容至100 mL，即得100 μg/mL葡萄糖标准溶液。分别吸取 0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL葡萄糖标准溶液，各以蒸馏水补至2.0 mL，然后加入5%苯酚水溶液1 mL，充分混合后再沿着试管壁缓慢滴入浓硫酸5 mL，迅速混合均匀后，室温放置30 min，在波长490 nm处测定吸光度（A）。以葡萄糖浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。

2.5.2 蜂花粉多糖含量的测定

准确称取2.3所得蜂花粉多糖100.0 mg，用蒸馏水定容至100 mL，取2.0 mL，按照2.5.1方法操作，于490 nm处读取吸光度，代入线性回归方程，求出样品液中多糖浓度，计算蜂花粉中多糖样品中多糖的含量（即多糖的纯度）及多糖的提取率：

蜂花粉中多糖样品中多糖含量/%=C×V×N×10-6/ M×100

式中：C为样品多糖浓度，μg/mL；V为待测样品总体积，mL；M为所称取蜂花粉多糖质量，g；N为稀释倍数，10-6，单位换算（1 g=106μg）。

蜂花粉多糖提取率/%=提取所得蜂花粉多糖质量/蜂花粉原料质量×100

2.6 方法学考察

2.6.1 重复性试验

准确称取蜂花粉100.00 g，共5份，按2.2、2.3法提取蜂花粉中的黄酮和多糖，按2.4、2.5法测定蜂花粉中的多糖含量和黄酮含量，分别计算RSD。

2.6.2 精密度试验

准确称取100.00 mg蜂花粉黄酮浸膏（或多糖），用50%乙醇（多糖用蒸馏水）定容到100 mL，分别按2.4.1、2.5.1法操作，各平行做5份，读取吸光，分别计算RSD。

2.6.3 稳定性试验

分别准确吸取2.6.2所得待测液2.0 mL，按2.4.1、2.5.1法操作，分别放置于室温0、15、30、60、90 min之后，读取吸光度，分别计算RSD。

3 结果和分析

3.1 蜂花粉黄酮和多糖测定结果

3.1.1 芦丁标准曲线

以芦丁浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，求得回归方程及标准曲线，结果如图1，芦丁浓度在20 μg/mL～120 μg/mL范围内线性良好。

图1 芦丁标准线（510 nm）Fig.1 Standard curves of rutin（510 nm）

3.1.2 葡萄糖标准曲

以葡萄糖浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，求得回归方程及标准曲线，结果如图2，葡萄糖浓度在0～60 μg/mL范围内线性良好。

图2 葡萄糖标准曲线（490 nm）Fig.2 Standard curve of glucose（490 nm）

3.1.3 蜂花粉多糖和黄酮的提取率及含量

蜂花粉1 200.00 g用石油醚脱脂2次后，用80%乙醇对其中黄酮进行提取2次，沉渣再进一步用水提醇法提取其中的多糖，然后用sevag法脱蛋白进行纯化蜂花粉多糖。试验得蜂花粉多糖37.32 g，黄酮浸膏30.72g。多糖提取率为（37.32 g÷1 200 g）×100%=3.11%，多糖样品中多糖的含量（即纯度）为91.6%，黄酮提取率为（30.72g÷1200g）×100%=2.56%，浸膏中黄酮的含量（即纯度）为82.3%。蜂花粉中多糖含量为91.6%× 3.11%×100%=2.85%，黄酮的含量为82.3%×2.56%× 100%=2.11%。

3.2 方法学考察结果

3.2.1 重复性试验

准确称取蜂花粉100.00，共5份，严格按2.2、2.3法提取蜂花粉中的黄酮和多糖，按2.4、2.5法测定蜂花粉中的多糖含量和黄酮含量，并计算多糖提取率、多糖纯度、黄酮提取率及黄酮纯度的RSD，结果分别为2.826%、1.992%、1.772%和2.517%。表明本试验方法有较好的重复性，偶然误差较小，测定方法可靠。结果见表1。

表1 重复性试验结果（n=5）Table 1 Results in repeated test（n=5）

3.2.2精密度试验

结果表明，5份黄酮待测样品，吸光度平均值A黄酮=0.428，RSD=1.760%，5份多糖待测样品，平均值A多糖=0.469，RSD=1.507%，表明仪器精密度良好。结果见表2。

表2 精密度试验结果（n=5）Table 2 Results in Precision test（n=5）

3.2.3 稳定性试验

结果表明，在90 min内连续测定5次，吸光度平均值A黄酮=0.428，RSD=2.947%，平均值A多糖= 0.469，RSD=2.632%，表明其在显色后的90 min内稳定性较好。结果见表3。

表3 稳定性试验结果（n=5）Table 3 Results in stability test（n=5）

3.3 结论

通过上述联合提取的方法，用80%乙醇对蜂花粉黄酮进行提取2次，再进一步用水提醇法提取其中的多糖，然后用sevag法脱蛋白进行纯化蜂花粉多糖。此方法能同时获取蜂花粉中的多糖和总黄酮。所得蜂花粉中黄酮的提取率为2.56%（RSD=1.722%，n=5），纯度为82.3%（RSD=2.517%，n=5），多糖提取率为3.11%（RSD=2.826%，n=5），纯度为91.6%（RSD=1.992%，n= 5）；精密度试验RSD黄酮=1.760%，RSD多糖=1.507%，稳定性试验中显色后的90 min内稳定性较好，RSD黄酮=2.947%，RSD多糖=2.632%。表明本试验方法具有较好的稳定性、重复性及准确度。因些，蜂花粉多糖和黄酮的联合提取是可行的，方法简单易行，既能节约时间又节约成本，同时还有较好的提取率。

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Extraction and Content Determination of Bee Pollen Polysaccharide and Flavonoids

ZHANG Cui-xiang，LUO Yong-hui*，XU Chun-ping，ZUO Shao-yuan
（School of Basic Medical Sciences，Dali University，Dali 671000，Yunnan，China）

This experiment by bee pollen as raw material，using petroleum ether reflux lipid and pigment，with two 80℃80%ethanol reflux extraction bee flowers pink yellow ketone；with 80℃water residue after three times，after alcohol sink，by sevag method to take off the protein.Calculation of polysaccharides and flavones extraction yield and purity，and the experimental method of repeatability，precision and stability test.Bee pollen medium yellow ketone extraction yield of 2.56%（RSD=1.722%，n=5），the purity of 82.3%（RSD= 2.517%，n=5），the polysaccharide extraction rate was 3.11%（RSD=2.826%，n=5），the purity of 91.6%（RSD=1.992%，n=5）；Precision test RSD=1.760%of flavonoids，polysaccharide RSD=1.507%，stability test of color within 90 min after stability isbetter，flavonoidsRSD=2.947%，polysaccharide RSD=2.632%.

bee pollen；polysaccharide；flavonoids；combined extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.013

2016-09-06

张翠香（1979—），女（彝），实验师，本科，从事行政管理和植物多糖研究。

*通信作者：罗永会（1967—），女（白），高级实验师，从事生物化学实验教学和植物成份提取的研究。