Zn（Ⅱ）亲和肽的分离纯化及肽-锌配合作用研究

张锦捷，袁杨，曾庆祝

（广州大学化学化工学院，广东广州510006）

Zn（Ⅱ）亲和肽的分离纯化及肽-锌配合作用研究

张锦捷，袁杨，曾庆祝*

（广州大学化学化工学院，广东广州510006）

采用自制的壳聚糖-Zn亲和层析介质对罗非鱼蛋白多肽进行分离纯化，筛选出与Zn2+有较强配位作用的亲和肽，并研究Zn2+与亲和肽的配位作用动力学及形成配合物的结构特征。采用高效液相色谱、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、紫外及红外光谱仪、扫描电子显微镜等分析手段对肽-锌配合物进行结构表征。结果表明，制备的壳聚糖-Zn亲和介质能够实现从罗非鱼蛋白酶解产物中选择性筛选分离出与Zn2+有较强配位作用的亲和肽；多肽原液、TP1组分、TP2组分与Zn2+通过配合反应形成肽-锌配合物的锌含量分别为8.533%、1.700%、16.87%；所得亲和肽与Zn2+具有较强配位作用，配合物的稳定常数为1.005×106，并分析了肽-锌配合物的基本结构特征。

亲和层析；多肽；锌离子；肽-锌配合物；配合作用

锌是人体必需的微量元素之一，它不但具有重要的生物功能，而且参与多种酶的合成与组成，与肌体的代谢及某些疾病的发生有极为密切的关系[1]。人体在进行正常的新陈代谢时，会造成人体内锌的大量流失，而食物中的锌仅有10%左右能被人体吸收，因此，人们普遍存在缺锌的现象[2]。相关研究表明，锌与氨基酸、多肽等配基形成螯合物或配合物后有助于机体对锌的吸收[3]。

固定化金属螯合亲和层析（IMAC）技术是利用蛋白质或多肽表面暴露的一些氨基酸残基与载体上的金属离子亲和力之间的差异来达到相关组分分离纯化的效果，目前主要用于蛋白质、酶、多肽及氨基酸的分离纯化[4]。谭天伟等[5]将壳聚糖附着在玻璃微珠上，通过在壳聚糖表面引入活性配基后螯合金属离子制成IMAC介质后用于分离纯化超氧化物歧化酶，试验结果表明，分离纯化效果良好，纯化倍数达20倍，回收率达89%。Larry Riggs等[6]设计了一种采用Ca（III）-IMAC进行多级层析分离蛋白质的方案，利用磷酸化肽与Ca（III）的亲和能力，实现对牛奶中磷酸化肽的选择性结合。

本文采用壳聚糖-Zn亲和层析介质从鱼蛋白水解产物多组份体系中筛选及选择性分离出与锌离子有较强亲和作用的多肽——亲和肽，进一步研究亲和肽与锌的配合作用动力学，并解析肽-锌配合物的分子结构特征，研究结果对深入探究微量元素-多肽配合物的功能活性及其应用具有参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

罗非鱼蛋白酶解液、壳聚糖-Zn亲和层析介质：广州大学化学化工实验室自制。

1.1.2 主要试剂

Alcalase蛋白酶（2.4L FG，2085283 U/g）：天津诺维信生物技术有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、冰乙酸、乙酸钠、乙二胺四乙酸二钠、乙酸锌、溴化钾、无水乙醇：天津市致远化学试剂有限公司。

1.1.3 主要仪器设备

CBS-A自动层析仪及恒流泵：上海沪西分析仪器厂有限公司；LC1260高效液相色谱液相仪：Agilent；FD-1A-50冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；NexION 300电感耦合等离子体质谱仪：PerkinElmer；JSM-7001F扫描电子显微镜：JEOL；Tensor27傅里叶变换红外光谱仪：Bruker。

1.2 方法

1.2.1 罗非鱼蛋白酶解液制备

鱼糜∶水=1∶3（质量比）→调pH值→加入Alcalase蛋白酶→50℃恒温酶解4 h→100℃灭活→冷却→抽滤→超滤→浓缩→干燥→收集备用

1.2.2 壳聚糖-Zn亲和层析介质制备[7]

参照文献[7]的制备方法。以壳聚糖微球为载体，环氧氯丙烷为活化剂、亚氨基二乙酸为螯合配基，氯化锌为螯合盐制备壳聚糖-锌亲和层析介质。

1.2.3 层析分离

壳聚糖-锌层析介质柱为1.0 cm×40 cm，用5倍体积缓冲液平衡，然后取2 mL一定浓度的酶解液上样，流速为1 mL/min。采用EDTA洗脱缓冲液洗脱，流速为1 mL/min，在280 nm波长下检测洗脱液各组分多肽含量，收集洗脱峰，浓缩，脱盐，冻干备用。

1.2.4 多肽含量测定

双缩脲法[8]。

1.2.5 多肽得率计算方法

1.2.6 肽-锌配合物的制备

多肽样液→加入乙酸锌→调pH 4.5→45℃水浴反应40 min→浓缩→加入无水乙醇→静置30 min→4 000 r/min离心→收集沉淀物（肽-锌配合物）→冷冻干燥→备用

1.2.7 肽-锌配合物的锌含量测定

采用ICP-MS法。

2 结果与讨论

2.1 Zn2+亲和肽的层析分离

比较了多肽样液浓度、磷酸盐缓冲液及乙酸钠缓冲液作为上样液、EDTA缓冲液为洗脱液对亲和肽分离纯化的影响。试验结果显示，多肽液上样浓度为20%，pH为4.0的乙酸-乙酸钠为缓冲液，EDTA洗脱液的浓度为0.2 mol/L，亲和肽的分离纯化效果较好，见图1。

图1 多肽液的亲和层析分离Fig.1 Chromatography spectra of peptides

2.2 亲和肽的高效液相分离纯化

亲和肽的高效液相分离纯化如图2所示。

亲和层析分离第二组分的高效液相色谱图谱中仅有唯一单峰，出峰时间在50 s左右，说明壳聚糖-Zn亲和层析介质对Zn2+亲和肽具有较好的分离纯化效果，所得亲和肽的纯度较高。

2.3 肽-锌配合物的锌含量

采用ICP-MS测定肽-锌配合物的锌含量，测定结果如表1所示。

图2 层析第二组分的高效液相色谱图谱Fig.2 Chromatogram of TP2

表1 各组分多肽与Zn2+配合形成肽-锌配合物的锌含量Table 1 Zn content in different zinc-peptide complex

由多肽原液制备的肽-锌配合物锌含量为8.533%，亲和层析第一组分为1.700%，第二组分为16.87%。可见，亲和层析所得第一组分多肽与锌离子的配位作用较弱，形成的配合物不多。第二组分形成的配合物锌含量明显高于多肽原液和第一组分，说明该组分多肽与锌离子的配位作用较强，是制备肽－Zn配合物的目标亲和肽。

2.4 肽－锌配合作用动力学分析

以多肽浓度与锌离子浓度比值为横坐标，吸光度（A值）为纵坐标，绘制A－C多肽/CZn2+曲线图，如图3所示。

图3 A-C多肽/CZn2+曲线图Fig.3 The plot of A-C多肽/CZn2+

图3发现，曲线在C多肽/CZn2+=2.5时出现明显的转折，据此判断锌离子与多肽进行配位作用的配位比为2.5∶1。

设配位作用的反应方程式为：mPep+nZn2+=PepmZnn，即m=1，n=2.5。

由图3可知，A1=0.761，A0=0.802，c=0.1 mol/L。

则解离度 α=（A0－A1）/A0=（0.802－0.761）/0.802= 0.051 12。

解离常数K′=（[M]m[N]n）/[MmNn]=（mmnnαm+ncm+n－1）/（1－α）=（1×2.52.5×（0.051 12）1+2.5×（0.1）1+2.5－1）/（1－0.005 112）= 9.947×10－7。

则稳定常数K=1/K′=1/9.947×10－7=1.005×106。

结果表明，肽与Zn2+通过配位作用形成的肽－锌配合物性质比较稳定。

2.5 肽－锌配合物的紫外－可见光谱分析

多肽及肽－锌配合物的紫外吸收光谱图如图4所示。

图4 多肽及其配合物的紫外吸收光谱Fig.4 UV spectra of peptide and zinc-binding peptide

多肽的吸收曲线最大吸收峰位于192 nm；肽－锌配合物的吸收曲线最大吸收峰位于197 nm，向长波方向移动了5 nm，且肽－锌配合物对应的吸收峰强度比多肽对应的吸收峰强度明显增强。这是由于多肽分子中的－COOH、－NH2、－OH等基团与锌离子发生配位作用，引起紫外吸收光谱的位移[9]。

2.6 肽－锌配合物的红外光谱分析

多肽、肽－锌配合物的红外光谱图如图5所示。

多肽与锌离子配位作用前后的红外图谱发生了明显变化。多肽在3 305.80 cm－1处吸收峰，与锌离子配位后移至3 284.58 cm－1；在3 080.24 cm－1处吸收峰，与锌离子配位后吸收峰消失，该吸收峰是由N－H伸缩振动引起。多肽在1 656.76 cm－1与1 398.13 cm－1处由COO－伸缩振动引起的吸收峰，与锌离子配位后分别移至1 591.18 cm－1与1 402.17 cm－1；在1 550.25 cm－1与1 448.15 cm－1处由NH2伸缩振动引起的吸收峰，与锌离子配位后消失。在1 045.00 cm－1～1 340.00 cm－1范围，多肽与肽－锌配合物的谱图中多处吸收峰发生变化；多肽－锌配合物分别在676.97 cm－1与619.11 cm－1处出现强的Zn-O伸缩振动吸收峰，这是由羧基与锌离子的配位作用形成的[10-12]。

图5 多肽与肽-锌配合物的红外光谱Fig.5 FT-IR spectra of peptide and zinc-binding peptide

2.7 肽-锌配合物的扫描电镜分析

多肽与肽-锌配合物的扫描电子显微镜照片如图6所示。

多肽与肽-锌配合物的电镜图有较大差异。肽-锌配合物呈现分布均匀的颗粒状，可能是由于多肽与锌离子配位后形成稳定的多环配位化合物，体现出类似球体的颗粒状。

3 结论

采用自制的壳聚糖-Zn亲和层析介质对罗非鱼蛋白多肽进行分离纯化，筛选出了与Zn2+有较强配位作用的亲和肽，分离纯化的适宜工艺条件为：上样缓冲液为乙酸-乙酸钠，pH为4.0；多肽原液上样浓度为20%；洗脱缓冲液为0.2 mol/L EDTA；通过高效液相色谱检测分析显示，目标多肽组分的分离纯化效果良好。通过ICP-MS测定多肽原液、TP1组分、TP2组分与锌配位反应后配合物中锌的含量，结果是第二组分多肽与锌通过配合作用形成配合物的锌含量最高，为16.87%，多肽与锌配位反应的稳定常数为1.005×106；通过对多肽及肽-锌配合物的紫外光谱、红外光谱、扫描电子显微镜等表征分析，证实锌离子与多肽发生了配位作用并生成肽-锌配合物。

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Purification and Complexation Reaction of Hydrolysis Peptide with Binding Zinc（II）

ZHANG Jin-jie，YUAN Yang，ZENG Qing-zhu*
（College of Chemical Engineering，Guangzhou University，Guangzhou 510006，Guangdong，China）

Tilapia protein hydrolysate peptide was separated and purified by using zinc chelating polysaccharide affinity chromatography media.And the complexation reaction of peptide with zinc was investigated.The structure characteristic of peptide-zinc complexes was characterized by HPLC，ICP-MS，UV-vis spectroscopy，FT-IR spectroscopy and SEM.The results showed that the tilapia hydrolysis polypeptide had been effectively purified and proved that chelating reaction between peptide and Zn2+had occurred and zinc-binding peptide complexes had been produced.The total zinc content of zinc-binding peptide complexes produced by hydrolysis polypeptide，TP1and TP2were 8.533%，1.700%and 16.87%，respectively.The properties of zinc-peptide complexes was stable whose stability constant was 1.005×106.

IMAC（immobilized metal-chelate affinity chromatography）；polypeptide；zinc-ion；zinc-peptide complexation；chelation reaction

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.010

2016-07-25

广东省科技计划项目（2015A020209192，2014A010107029）；广州市科技计划项目（201604020089）；广州市黄埔区科技计划项目（201516/20150000644）

张锦捷（1989—），男（汉），硕士，研究方向：食品加工副产物的高值化利用。

*通信作者：曾庆祝（1965—），男，教授，博士，研究方向：生物活性肽及其功能性。