响应面法优化北五味子水溶性糖蛋白提取工艺

刘畅，田双，杨洋，赵武，邵帅，严铭铭

（长春中医药大学，吉林长春130117）

响应面法优化北五味子水溶性糖蛋白提取工艺

刘畅，田双，杨洋，赵武，邵帅*，严铭铭*

（长春中医药大学，吉林长春130117）

为探讨碱提酸沉法提取北五味子水溶性糖蛋白的最优条件，采用响应面分析法，在单因素试验的基础上，选择料液比、浸提时间、浸提温度和碱提液pH值为影响因素，以蛋白得率和糖得率为响应值，采用中心组合Box-Benhnken法建立数学模型，进行响应面分析。结果表明，碱提酸沉法提取北五味子水溶性糖蛋白的最佳工艺条件为：料液比1∶35（g/mL），碱提液pH 9.5，浸提温度35℃，浸提时间3 h，该条件下蛋白质得率为7.72%，糖得率为19.24%。

北五味子；水溶性糖蛋白；提取；响应面分析

糖蛋白是一种结合蛋白，由短的寡糖链与蛋白质共价相连构成的分子，以蛋白质为主，通过共价键与若干短的寡糖链相连，其总体性质更接近蛋白质[1]。随着糖生物学的不断发展，研究发现作为糖缀合物的糖蛋白，表现出许多重要的生物学功能，具有抗肿瘤[2]、抗氧化[3]、调节免疫、防衰老、降血脂、降血糖[4]等功效。植物源性的糖蛋白具有来源丰富、易获得、成本低等特点。植物糖蛋白的一些生物活性具有较高的利用价值，在生化、医药、食品等领域得到了越来越多的认可[5]，因此植物中的糖蛋白也成为了当今研究的热点之一。

五味子为木兰科植物五味子的干燥成熟果实，习称“北五味子”。北五味子主产地为辽宁、黑龙江、吉林等，本草中列为上品，认为有益气、明目、补不足、养五脏、壮筋骨的作用，且具有滋肾敛肺、生津收汗、涩精、安神之功能[6]。目前，针对北五味子的开发利用研究主要集中在木脂素类、多糖类、挥发油类等方面，对北五味子糖蛋白及其生物活性的研究国内外尚未报道。因此，本文采用响应面分析法对北五味子水溶性糖蛋白的提取工艺进行优化，确定最佳工艺参数，旨在为提高北五味子资源的综合利用及深加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

五味子：采于吉林省长白山，经长春中医药大学药学院姜大成教授鉴定为木兰科植物五味子Schisan－dra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实。

Bradford蛋白浓度测定试剂盒：天根生化科技有限公司；葡萄糖、苯酚、浓硫酸、氢氧化钠、浓盐酸：国产分析纯。

TDL-5型台式离心机：上海安亭科学仪器厂；S82-2型磁力搅拌器：上海志威电器有限公司；UB-7型pH计：美国丹佛仪器公司；UV-1700型紫外-可见分光光度计：日本岛津；FDU-1200型冷冻干燥机：东京理化；KYH-111型高级商用沙冰料理机：中山市快特电器有限公司；MiniSpin Plus型超高速小型离心机：德国Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 分析测定方法

1.2.1.1 糖蛋白中蛋白质含量的测定

采用考马斯亮蓝Bradfrod法测定糖蛋白中蛋白质的含量。牛血清蛋白标准曲线的绘制：各取0、10、20、30、40、50、60 μL牛血清白蛋白标准溶液（1 mg/mL），用PBS补足到150 μL后，加入2.85 mL考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置5 min，在可见-紫外分光光度计595 nm处测定吸光度值，以牛血清蛋白质量（μg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线。稀释后的样品溶液用上述方法测定，由标准曲线求得其质量浓度。

1.2.1.2 糖蛋白中多糖含量的测定[7]

采用苯酚-浓硫酸法测定糖蛋白中多糖的含量。葡萄糖标准曲线的绘制：将葡萄糖配制成0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液，分别取1、2、3、4、5mL定容至10mL，再从中取出1 mL，加质量分数5%苯酚1 mL，5 mL浓硫酸，涡旋混匀，室温放置30 min。于波长490 nm处测定吸光度值，以葡萄糖标准溶液浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线。稀释后的样品溶液用上述方法测定，由标准曲线求得其质量浓度。

1.2.1.3 蛋白质与糖得率的计算

式中：r为蛋白或糖得率，%；C为测得样品溶液的蛋白质或糖质量浓度，μg/mL；D为样品溶液的稀释倍数；V为样品溶液的体积，mL；m为五味子样品的质量，g。

1.2.2 北五味子水溶性糖蛋白的提取工艺流程

五味子干燥果实→按照一定料液比匀浆→用1 mol/LNaOH将碱提液调至一定pH值→在一定温度下，浸提一定时间→离心→上清液→酸沉→离心→沉淀物冷冻干燥→北五味子水溶性糖蛋白

1.2.3 单因素试验设计

以蛋白质及糖的得率为研究指标，以料液比、浸提时间、浸提温度、碱提液pH值为影响因素，对北五味子水溶性糖蛋白提取工艺进行单因素试验。分别考察料液比[1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45（g/mL）]、浸提时间（1、2、3、4、5 h）、浸提温度（4、25、35、45、55℃）和碱提液pH值（8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）对北五味子水溶性糖蛋白提取效果的影响。

1.2.4 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，采用响应面法中Box-Benhnken中心组合试验设计原理，以料液比（A）、碱提液pH（B）、浸提温度（C）和浸提时间（D）为自变量，蛋白得率（Y1）和糖得率（Y2）为响应值，采用Box－Benhnken中心组合模型进行响应面分析，试验因素水平编码见表1。

表1 Box－Benhnken试验因素水平表Table 1 Box－Benhnken test factor－levels table

2 结果与分析

2.1 牛血清白蛋白标准曲线

牛血清白蛋白标准曲线见图1。

图1 牛血清蛋白标准曲线Fig.1 The standard curve of bovine serum protein

由图1可见，标准曲线的回归方程为：y=0.002x+ 0.069 1（R2=0.998 2），蛋白在66.67 μg/mL～400 μg/mL范围内呈良好的线性关系。根据样品溶液的吸光度值，对应牛血清蛋白标准曲线，可以计算蛋白含量，进一步可计算蛋白得率。

2.2 葡萄糖标准曲线

葡萄糖标准曲线见图2。

由图2可见，标准曲线的回归方程为：y=0.013 2x-0.034 4（R2=0.992 9），葡萄糖在10 μg/mL～50 μg/mL范围内呈良好的线性关系。根据样品溶液的吸光度值，对应葡萄糖标准曲线，可以计算多糖含量，进一步可计算糖的得率。

图2 葡萄糖标准曲线Fig.2 The standard curve of glucose

2.3 北五味子水溶性糖蛋白提取工艺参数单因素试验

2.3.1 不同料液比对提取效果的影响

当浸提温度25℃、提取时间2 h，pH为10时，以料液比为变量进行3次平行试验，结果见图3。

图3 料液比对蛋白与糖得率的影响Fig.3 Effect of solid/solvent ratio on yield of protein and saccharide

由图3可知，蛋白与糖的得率随着料液比的增加而逐渐升高，可能是随着料液比的增加，糖蛋白得以充分的溶胀，当料液比超过1∶35（g/mL）后，蛋白与糖得率曲线接近水平，蛋白与糖得率随料液比升高而增加缓慢，考虑到资源的合理利用和后期样品回收等因素，料液比不宜选择过大。因此，料液比以1∶35（g/mL）为宜。

2.3.2 不同碱提液pH值对提取率的影响

固定料液比1∶35（g/mL），浸提温度25℃、提取时间2 h，以碱提液pH值为变量进行3次平行试验，结果见图4。

由图4可知，由于pH值的改变可以使蛋白质的带电情况发生改变，进而影响蛋白质之间，以及蛋白质和水之间的相互作用。北五味子水溶性糖蛋白的等电点偏低，因此合适的碱提液对糖蛋白的提取更加有利，随着pH值的增加，提取率也逐渐增大，但是过高的pH值容易使蛋白变性。另外，在试验中发现，pH值的改变会影响所提取的五味子水溶性糖蛋白的颜色，而且随着pH值的增大颜色也越深，pH值在9～10范围内时颜色较浅。综合考虑，碱提液pH以9.5为宜。

图4 碱提pH值对蛋白与糖得率的影响Fig.4 Effect of pH on yield of protein and saccharide

2.3.3 浸提温度对提取率的影响

固定料液比1∶35（g/mL），碱提液pH 9.5，提取时间2 h，以浸提温度为变量进行3次平行试验，结果见图5。

图5 浸提温度对蛋白与糖得率的影响Fig.5 Effect of temperature on yield of protein and saccharide

由图5可知，随着温度的升高，糖蛋白的得率也随之增加，在35℃时蛋白及糖的得率达到最大，再升高温度蛋白及糖的得率迅速减小，这是由于温度过低时蛋白不能充分的溶解在提取溶剂中；温度过高又极易引起蛋白质的变性。因此，初步确定浸提温度为35℃。

2.3.4 浸提时间对提取率的影响

固定料液比1∶35（g/mL），碱提液pH 9.5，浸提温度为35℃，以浸提时间为变量进行3次平行试验，结果见图6。

图6 浸提时间对蛋白与糖得率的影响Fig.6 Effect of time on yield of protein and saccharide

由图6可知，在1 h～3 h范围内，随着匀浆后的五味子被碱液充分浸提，使得溶出率也随之增加，蛋白及糖的得率逐渐上升。在3 h之后蛋白及糖的得率增加缓慢，这是由于时间的增长能促进颗粒胞膜的破裂，有利于蛋白质和糖的析出，但是当时间达到一定后，提取液中的有效成分浓度基本达到平衡，对蛋白及糖的得率影响较小，因此最佳的浸提时间为3 h。

2.4 响应面法优化北五味子水溶性糖蛋白的提取工艺

2.4.1 回归模型的建立与数据分析

按照试验设计方案进行试验，结果如表2所示。

表2 响应面试验结果Table 2 The experiment result of response surface

续表2 响应面试验结果Continue table 2 The experiment result of response surface

应用Design－Expert 8.0.5b软件对表2中蛋白质得率和糖得率进行回归拟合，得到二次回归方程。其中，蛋白质得率的回归方程为：

糖得率的回归方程为：

对试验所得数据模型进行方差分析，结果见表3。

表3 响应面试验方差分析Table 3 Variance analysis of response surface

蛋白质得率和糖得率方程的模型显著性P＜0.0001，是极显著的，说明方程有意义，而蛋白质得率和糖得率的失拟项P值分别为0.343 5、0.694 3，差异不显著（P＞0.05），即模型与试验的差异较小，说明其他因素对试验结果的干扰较小，残差由随机误差引起，能充分反映各因素和响应值之间的关系。另外蛋白质得率与糖得率回归方程的相关系数R2分别为0.939 1和0.985 8，均大于0.9，说明预测值与试验值有较好的相关性，因此可以用回归方程对试验结果进行分析和预测[8]。

同时，通过方程发现各种因素之间存在着一定的交互作用，其中蛋白质得率回归方程A、B、C、AC、B2、C2、D2均呈极显著影响（P＜0.01），D呈显著影响（P＜0.05），糖得率回归方程A、B、C、D、AC、A2、B2、C2、D2均呈极显著影响（P＜0.01），BC呈显著影响（P＜0.05）。

由方程的一次项系数可以得出，影响碱提酸沉法提取北五味子水溶性糖蛋白得率的因素的主次顺序为料液比（A）＞浸提温度（C）＞碱提pH值（B）＞浸提时间（D）。

2.4.2 响应面分析

响应面分析见图7。

图7 各因素交互作用的响应面图Fig.7 Responsive surface of interaction between factor

运用回归模型得出北五味子水溶性糖蛋白的最优提取工艺条件为料液比1∶35.00（g/mL），碱提液pH 9.69，浸提温度34.40℃，浸提时间3.09 h，得到的蛋白质得率为7.91%，糖得率为19.35%。

2.4.3 验证试验

考虑到实际操作的要求，将响应面法优化的最佳提取工艺条件修正为：料液比1∶35（g/mL），碱提液pH9.5，浸提温度35℃，浸提时间3 h。经过3组平行试验，得到的蛋白质得率为7.72%，糖得率为19.24%，接近于最优条件的预测值，因此，采用响应面分析法优化得到的工艺参数准确可靠，有很好的应用价值。

3 结论

使用响应面法试验设计，克服了正交设计只能处理离散的水平值，而无法找出整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值的缺陷，并能减少试验次数，分析几种因素间的交互作用，以达到较全面地反映各因素水平的效果[9－12]。本试验利用响应面法对北五味子水溶性糖蛋白的提取条件进行优选，首先考察了单因素料液比、浸提时间、浸提温度和碱提液pH值对北五味子水溶性糖蛋白提取效果的影响，最终确定最佳提取工艺条件为：碱提液pH9.5，料液比1∶35（g/mL），浸提温度35℃，浸提时间3 h，得到的蛋白质得率为7.72%，糖得率为19.24%。

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Optimization of Extraction Process for Water-soluble Glycoprotein from Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.by Response Surface Analysis

LIU Chang，TIAN Shuang，YANG Yang，ZHAO Wu，SHAO Shuai*，YAN Ming-ming*
（Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，Jilin，China）

To optimize alkali extraction and acid precipitation process of water-soluble glycoprotein from Schisandra chinensis（Turcz.）Baill..On the basis of one-factor-at-a-time experiments，a mathematical model describing the effects of solid/solvent ratio，pH，temperature and time on yield of protein and saccharide were created using Box-Behnken experimental design and analyzed by response surface methodology.The optimum conditions for extracting water-soluble glycoprotein from Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.were determined as 1∶35（g/mL），pH 9.5，35℃and 3 h for solid/solvent ratio，pH，temperature and time，respectively.Under these conditions，the maximum theoretical extraction yield of protein was 7.72%，saccharide was 19.24%.

Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.；water-soluble glycoprotein；extraction；response surface optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.009

2016-09-02

吉林省重点科技攻关项目（20140204070YY）；吉林省教育厅“十三五”科学技术研究项目（2016024）

刘畅（1993—），女（汉），在读硕士，从事中药化学及新药开发研究。

*通信作者：邵帅，副教授，博士，从事药物化学、中药化学及保健食品研究；严铭铭，教授，博士，从事药物化学、中药化学及新药开发研究。