酸浆果实中多酚的提取及其抗氧化能力研究

武乾英，王晓闻，郭瑜，许惠芳，王艳丽

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷030801）

酸浆果实中多酚的提取及其抗氧化能力研究

武乾英，王晓闻*，郭瑜，许惠芳，王艳丽

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷030801）

以酸浆果实为研究对象，对其多酚提取工艺进行优化并分析其（Ferric reducing antioxidant power，FRAP）还原亚铁离子的能力）。采用响应面法对乙醇体积分数、料液比、温度、提取时间进行优化，确定酸浆果实多酚的最佳提取条件，并采用FRAP对多酚提取物的体外抗氧化能力进行分析。结果表明：酸浆果实多酚的最佳提取条件为乙醇体积分数61.5%、料液比1∶15（g/mL）、浸提温度59℃、提取时间102 min，所得多酚得率为0.899%DW，与预测值偏差不大。酸浆多酚10 mg/mL时FRAP值为0.495 mmol/L。研究表明酸浆果实中含有多酚类物质，且具有一定的还原亚铁离子的能力。

酸浆果实；多酚；提取；亚铁离子还原能力

酸浆 [Physalis alkekengi L.var.franchetii（Mast.）Makino]为茄科酸浆属多年生草本植物，又名天泡果、灯笼草等，属野生资源，目前被认为是一种具有较高营养价值的稀特果蔬[1]。酸浆的根及全草入药，具有利咽、化痰、清热、利尿等功能。由于其含有多种甾类化合物，所以中医药上可广泛应用于解毒等[2]。

酸浆果实中含有丰富的常量元素及多种微量元素[3-4]。同时酸浆果实中含有丰富多种的植物化学成分，目前对酸浆的研究多集中在酸浆苦素、皂苷类及生物碱类的活性分析，然而酸浆果实中的多酚类物质的研究甚少。

因此本研究采用响应曲面法对酸浆果实中多酚的提取条件进行优化，并采用FRAP法分析其体外总抗氧能力，为提高酸浆的综合利用率提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酸浆果实粉末：酸浆果实采自山西省大同市阳高县。将新鲜酸浆果实脱萼、除杂、清洗后，榨汁并冷冻干燥，经粉碎、40目过筛即得酸浆果实粉末，置于－80℃保存备用。

乙醇、乙醚、没食子酸、碳酸钠、FeSO4、醋酸缓冲液、盐酸、三氯化铁（均为AR级）；2，4，6－三吡啶基三嗪（TPTZ）、Folin－Ciocalteu：北京索莱宝科技有限公司。

JYZ－D51榨汁机：九阳股份有限公司；R－1001N旋转蒸发仪、SHB－III循环水式真空泵、WB－200水浴锅：郑州长城科工贸有限公司；BS210S电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；JDG－0.2真空冷冻干燥机：兰州科近真空冻干技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的绘制及多酚含量的测定

配制没食子酸标准液浓度为0、20、40、60、80、100 μg/mL样液。取样液0.2 mL，加入2%Na2CO3溶液4 mL，福林试剂0.2 mL，摇匀置25℃恒温水浴中放置30 min，765 nm下测定吸光值。得到吸光度值X与没食子酸标准溶液浓度（Y，mg/mL）之间的回归方程为：Y=0.033 54X－0.001 09，R2=0.999 52。

1.2.2 酸浆果实中多酚的提取及其测定

称取1 g的酸浆果粉，按照一定的料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）加入一定体积分数的乙醇溶液（0%、20%、40%、60%、80%、100%），在一定温度（20、30、40、50、60、70℃）下提取一定时间（40、60、80、100、120、140 min）后，离心除杂。收集上清液减压浓缩，并用乙醚脱脂，采用福林酚法测定样品中的多酚含量及其得率。将提取的酸浆果实多酚粗提液定容至100 mL，按照以上方法，取样液0.2 mL，加入2%Na2CO3溶液4 mL，福林试剂0.2 mL，摇匀置25℃恒温水浴中放置30 min，765 nm下测定吸光值，平行3次测定其吸光值，根据标准曲线测定其对应的多酚得率，结果按下式计算：

式中：W为多酚的得率，%；C为由粗提液测定吸光值后，在标准曲线中所对应没食子酸质量浓度，mg/mL；V为提取液定容后的体积，100 mL；m为称样量，g。

1.2.3 单因素试验及其响应曲面法确定最佳提取工艺

1.2.3.1 单因素试验

以1.2.2中4组因素做单因素试验，每组试验平行进行3次，确定各因素适宜的范围。

1.2.3.2 响应曲面法试验设计确定最佳提取工艺

在单因素试验基础上，确定中心组合试验设计的自变量及水平。根据Box－Behnken中心组合试验设计原理，以多酚含量为响应值，选取乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度4个因素，设计四因素三水平响应面分析试验，用响应面分析方法对数据进行回归分析及显著性检验，来确定最佳工艺参数。

1.2.4 亚铁离子还原能力分析法（FRAP）测定酸浆多酚抗氧化能力

FRAP工作液：2.5 mL10 mmol/L的TPTZ工作液（用40 mmol/L的盐酸溶解），2.5 mL 20 mmol/L的FeCl3·6H2O和25 mL 0.3 mol/L的醋酸缓冲液（pH3.6）混合均匀即得。

配制1 mmol/L的FeSO4溶液。在0～400 μL范围内取不同体积于试管中，加蒸馏水到2 mL，用FRAP工作液加到5 mL，摇匀，在室温放置30 min，在593 nm处测吸光值。以吸光值为纵坐标，FeSO4浓度为横坐标，得标准曲线回归方程为Y=0.000 59X－0.012 31，R2= 0.996 42。

将多酚粗提物进行纯化后（纯度为58.33%）配制为溶液，取同样体积的不同浓度多酚样品溶液，加蒸馏水到2 mL处，再加FRAP工作液至5 mL，摇匀，室温放置30 min，不加样品改为加蒸馏水作为参照，在593 nm处测吸光值，每个平行测定3次，取平均值。由还原力标准曲线，得出相同吸光度值处FeSO4的浓度，将此浓度的数值作为FRAP值。

2 结果与分析

2.1 提取条件对多酚提取效果的影响

2.1.1 乙醇浓度对酸浆多酚含量的影响

精确称取1 g酸浆果粉，按照1∶15（g/mL）的料液比加入一定体积分数的乙醇溶液（0%、20%、40%、60%、80%、100%），在60℃下提取100 min，乙醇浓度对酸浆多酚含量的影响结果见图1。

图1 乙醇体积分数对酸浆多酚得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction of polyphenols

由图1可以看出，酸浆多酚提取量随着乙醇体积分数的增大而先增加后减小，在60%时达到最大值，为7.654 mg/g，得率为0.765%。当乙醇浓度过高时，溶剂的极性过低，从而导致提取量下降，而且会导致酸浆苦素等其他物质的提出，给之后的纯化及其抗氧化试验造成影响。因此，选择60%的乙醇作为提取溶剂。后续响应面试验乙醇体积分数确定为50%、60%、70%3个水平。

2.1.2 料液比对酸浆多酚浓度的影响

精确称取1 g酸浆果粉，按照一定的料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）加入体积分数60%的乙醇溶液，在60℃下提取100 min，料液比对酸浆多酚含量的影响结果见图2。

图2 料液比对酸浆多酚得率的影响Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction of polyphenols

由图2可以看出，料液比在1∶10（g/mL）～1∶15（g/ mL）的范围内，多酚的提取量得到了明显提高，将料液比继续提高对酸浆多酚的提取量无显著性影响。除此之外，料液比过大能够造成资源的浪费。因此，最佳料液比为1∶15（g/mL）。后续响应面试验料液比确定为1∶10、1∶15、1∶20（g/mL）。

2.1.3 提取时间对多酚含量的影响

精确称取1 g酸浆果粉，按照料液比1∶15（g/mL）加入体积分数60%的乙醇溶液，在60℃下提取一定时间（40、60、80、100、120、140 min），提取时间对酸浆多酚含量的影响结果见图3。

图3 提取时间对酸浆多酚得率的影响Fig.3 Effect of time on the extraction of polyphenols

由图3可以看出，在100 min内，多酚提取量随着时间的变长而增大，当提取时间为100 min时，提取量最大为8.712 mg/g，得率为0.871%。时间较短时，结合氢键不能完全被破坏，时间过长时，则会引起其中多酚的损失。后续响应面试验提取时间确定为80、100、120 min。

2.1.4 提取温度对多酚含量的影响

精确称取1 g酸浆果粉，按照1∶15（g/mL）的料液比加入体积分数为60%的乙醇溶液，在一定温度（20、30、40、50、60、70℃）下提取100 min，提取温度对酸浆多酚含量的影响结果见图4。

图4 提取温度对酸浆多酚得率的影响Fig.4 Effect of temperature on the extraction of polyphenols

由图4可以看出，在30℃～60℃范围内，随着温度的升高，多酚提取量升高，在60℃达到最高点，提取量为8.318 mg/g，得率为0.832%。温度进一步升高，高温促使多酚类物质的氧化变性，因此，多酚得率有着明显的下降。因此，选择60℃作为最佳提取温度。后续响应面试验确定提取温度为50、60、70℃。

2.2 响应面分析

2.2.1 多元二次响应面回归模型的建立

因素水平编码见表1。试验结果如表2。

表1 因素水平编码表Table 1 The coding table of factors and levels

表2 响应面分析试验设计与结果Table 2 The design and results of response surface experiments

续表2 响应面分析试验设计与结果Continue table 2 The design and results of response surface experiments

2.2.2 方差分析与显著性检验

通过Design Expert数据分析软件进行回归分析，得到的方差分析结果如表3所示。

表3 方差分析结果Table 3 The results of variance analysis

由表3可知，模型P＜0.05，该二次方程模型达到显著水平，模型失拟项P值为0.120 7＞0.05，失拟项不显著，说明其他情况对模型干扰程度小，该响应面回归模型拟合度良好。在该模型中，对多酚含量有显著影响的有 B、C、AD、A2、B2及D2，该模型信噪比为7.128，该值大于4则表明该模型可以用于预测，该模型拟合优度R2和调整R2分别为0.145 8与0.569 8，两者的差值在可以接受的范围内。对表2的试验数据进行二次多项式回归拟合，得到以乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度为自变量的四元二次回归方程：

2.2.3 酸浆多酚提取量响应面分析

酸浆多酚提取量响应面分析见图5。通过Box－Behnken试验得到的多元二次回归模型所作的响应面图及其高线图可用于评价试验因素对酸浆多酚得率影响的两两交互作用以及确定各个因素的最佳水平范围。

图5 乙醇体积分数和提取温度对酸浆多酚得率影响的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface contour plots showing the effects of ethanol concentration and temperatureon the extraction of polyphenols

图5表明，固定乙醇体积分数、多酚得率随着提取温度的升高而增加，但是温度过高容易使多酚发生氧化，从而降低得率；固定提取温度，多酚得率随乙醇体积分数的增加先增加后减小。

通过数据分析，提取酸浆多酚最佳工艺条件为：乙醇体积分数61.53%、料液比1∶15.28（g/mL）、浸提温度58.93℃、提取时间102.35 min，多酚的提取量为9.048 mg/g，得率为0.905%。考虑到可操作性，将条件调整为乙醇体积分数61.5%、料液比1∶15（g/mL）、浸提温度59℃、提取时间102 min，进行验证试验得到多酚含量为8.986 mg/g，得率为0.899%。与理论值基本相符，进一步验证了回归模型的可靠性，因此响应面法对酸浆多酚提取的条件优化是可行的。

2.3 FRAP法测定酸浆多酚提取物抗氧化能力

不同浓度酸浆多酚及其对应的FRAP值如图6所示。

图6 多酚浓度与FRAP值的相关性Fig.6 The correlation between the polyphenols and ferric reducing antioxidant power

从图6可以看出，随着酸浆多酚浓度的增加，FRAP值也在不断增加，即抗氧化活性不断增加。酸浆多酚还原亚铁离子的能力与其浓度总体呈依赖关系。当酸浆多酚浓度为10 mg/mL时FRAP值为0.495 mmol/mL，表明其有潜在的体外抗氧化能力。

3 结论

经优化后，酸浆多酚的提取条件为乙醇体积分数61.5%、料液比1∶15（g/mL）、浸提温度59℃、提取时间102 min，进行验证试验得到多酚含量为8.986 mg/g，得率为0.899%，与理论值基本相符，进一步验证了回归模型的可靠性。之后将酸浆多酚粗提物纯化后纯度为58.33%。同时研究表明酸浆多酚浓度为10 mg/mL时FRAP值为0.495 mmol/mL，对亚铁离子有一定的还原能力，该提取物具有一定的体外抗氧化能力。

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Extraction and Antioxidant Activity of Polyphenols from Physalis alkekengi Fruit

WU Qian-ying，WANG Xiao-wen*，GUO Yu，XU Hui-fang，WANG Yan-li
（College of Food Science and Engineering，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，Shanxi，China）

The optimal extraction conditions and FRAP（ferric reducing antioxidant power）of polyphenols from Physalis alkekengi L.vdx.franchetii（Mast）Makino fruit were investigated.Response surface methodology was employed to optimize extraction process of polyphenols from P.alkekengi fruit by taking ethanol concentration，solid-liquid ratio，extraction temperature and extraction time as factors，and its antioxidant activity was investigated by observing its FRAP.The optimized conditions were as follows：the ethanol concentration was 61.5%，theproportionofsolid-liquidwas1∶15（g/mL），theextractiontemperaturewas59℃，andtheextractiontime was 102 min.Under the optimal conditions，the maximum extraction amounts of polyphenols was 0.899%DW.For polyphenols from P.alkekengi fruit，the maximum FRAP value was 0.495mmol/L at a concentration of 10 mg/mL.The results demonstrated that P.alkekengi fruit rich in polyphenols had a certain in ferric reducing antioxidant power.

Physalis alkekengi fruit；polyphenols；extraction；ferric reducing antioxidant power

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.008

2016-08-19

山西省国际科技合作项目（2015081024）；山西省科技攻关项目（20150311020-2）；山西省回国留学人员科研资助项目（2016-073）

武乾英（1991—），男（汉），硕士研究生，研究方向：食品营养与安全。

*通信作者：王晓闻（1968—），女（汉），教授，硕士生导师，博士，研究方向：食品营养与安全。