枯草芽孢杆菌对黑木耳发酵液糖类成分降解规律的影响

2017-05-18王斌张腾霄张春华陈洪玉苏适于德

山东农业科学 2017年4期

王斌　张腾霄　张春华　陈洪玉　苏适　于德涵　黎莉

摘要：为开发以黑木耳为原料的益生菌保健品提供理论支持，以黑木耳子实体为主要原料配制培养液，接入纯培养后的枯草芽孢杆菌，在36、46℃条件下分别进行发酵培养，测定0～60 h内发酵液中总糖、还原糖浓度，计算发酵液中多糖浓度及枯草芽孢杆菌菌落数。结果表明，总糖和多糖含量的变化均呈先下降上升再下降后趋于平稳的趋势，还原糖含量的变化36℃条件下呈先下降后上升的趋势，46℃条件下呈先下降后上升再下降的趋势；大部分发酵过程中，46℃发酵条件下发酵液的总糖、多糖、还原糖含量高于36℃发酵条件；两种发酵条件下菌落数的变化趋势是先上升后下降再上升后略下降。从糖类降解程度和活性菌体数量确定枯草芽孢杆菌发酵黑木耳子实体的最佳工艺为发酵温度46℃，发酵时间24 h。

关键词：枯草芽孢杆菌；黑木耳；总糖；多糖；还原糖；降解规律

中图分类号：S646.609.9 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）04-0068-04

Study on Degradation of Sugars in Black Fungus

Fermentation Broth Affected by Bacillus subtilis

Wang Bin， Zhang Tengxiao， Zhang Chunhua， Chen Hongyu， Su Shi， Yu Dehan， Li Li

（Department of Food and Pharmaceutical Engineering， Suihua University， Suihua 152061， China）

Abstract The effects of Bacillus subtilis on degradation rule of sugars in black fungus fermentation broth was studied in order to provide theoretical supports for the development of probiotic health care products with black fungus as raw material. The pure cultured Bacillus subtilis was inoculated into the culture liquid with black agaric fruiting body as main raw material and cultured at 36℃ and 46℃ respectively by fermentation. The total sugar and reducing sugar concentration were determined in the fermentation liquid in 0～60 hours， and the polysaccharide concentration and Bacillus subtilis colony number were calculated. The results showed that the contents of total sugars and polysaccharide decreased firstly， then increased， and then decreased to tend to stablization. The content of reducing sugars decreased firstly and then increased at 36℃， but decreased firstly， then increased and then decreased at 46℃. In most of the fermentation process， the total sugar， polysaccharide and reducing sugar contents at 46℃ were higher than those at 36℃. The change trend of colony number in the two kinds of fermentation conditions both increased firstly followed by decrease， and then increased followed by slight decrease. Comprehensively considering the sugar degradation and colony number， the optimum fermentation technology for black agaric fruiting body with Bacillus subtilis was fermented for 24 hours at 46℃.

Keywords Bacillus subtilis； Black fungus； Total sugar； Polysaccharide； Reducing sugar； Degradation rule

黑木耳是一種药食同源的食用菌，主要分布于黑龙江、吉林等地，具有凉血、止血、补气耐饥、补胃理气和活血的功效[1]。黑木耳中含有多糖、腺苷类物质、黑色素、麦角甾醇、磷脂类及多种维生素等化学成分。研究表明，黑木耳多糖是重要的活性成分，具有调节免疫功能、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、降血糖、降血脂、抗凝血、抗演疡、抗肝炎、抗生育、抗感染、促进血清蛋白生物合成和淋巴细胞核酸生物合成等作用[2]。随着对活性成分的深入研究，黑木耳深加工制品种类也比较丰富，一类是非发酵制品，如黑木耳粉、黑木耳酱、黑木耳果冻、黑木耳冰淇淋、黑木耳复合饮料、黑木耳膨化脆片、黑木耳软糖、黑木耳五香干、黑木耳方便面、黑木耳威化饼、黑木耳甜羹、黑木耳蜜饯等；另一类是发酵类制品，如黑木耳发酵饮料、黑木耳果醋、黑木耳酸奶等[3-11]。利用黑木耳开发功能性食品添加剂、保健品或药品的市场前景更加广阔。枯草芽孢杆菌是一种对人和动物安全有益的微生物，其活菌制剂作为口服液用于治疗肠炎、支气管炎和腹泻等多种疾病。本试验以黑木耳子实体为主要原料配制培养液，接入纯培养的枯草芽孢杆菌并进行发酵，探究枯草芽孢杆菌对发酵液中黑木耳子实体糖类成分降解规律的影响因素，为开发以黑木耳为原料的益生菌保健品提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黑木耳购于绥化市华辰超市，产地黑龙江省大兴安岭地区；实验试剂有葡萄糖、苯酚、浓盐酸、浓硫酸、3，5-二硝基水杨酸（DNS）、氢氧化钠、枯草杆菌二联活菌颗粒、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂等，均为分析纯。

1.2 主要仪器

FW100高效万能粉碎机，天津市泰斯仪器有限公司；FA2104电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；SW-CJ-2F双人双面净化工作台，苏州净化设备有限公司；YXQ-LS-50SII型立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SHA-B水浴恒温振荡器，天津市泰斯仪器有限公司；HPX-9162MBE数显电热培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；752型紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司。

1.3 枯草芽孢杆菌的分离

枯草杆菌二联活菌颗粒主要成分是枯草芽孢杆菌和屎肠球菌，根据枯草芽孢杆菌可耐受60℃高温而屎肠球菌不能耐受60℃高温来分离枯草芽孢杆菌。采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，经高温灭菌、倒平板、连续浓度梯度稀释处理、涂布后，一组置于60℃培养箱中培养50 min，再放入37℃培养箱中培养36 h，一组直接置于37℃培养箱中培养36 h，获得菌落。通过显微镜镜检和菌落形态鉴定，判断获得菌落是否为枯草芽孢杆菌纯菌落。60℃处理后培养获得的菌落形态符合枯草芽孢杆菌的典型形态特征，所有菌体呈杆状，说明获得了枯草芽孢杆菌纯培养物；直接37℃培养获得的菌落，显微镜下观察是球状菌和杆状菌混合体，说明没有获得枯草芽孢杆菌纯培养物。将获得的枯草芽孢杆菌纯培养物的菌落采用连续划线法连续传代培养2次，得到的菌落作为后续发酵实验菌种。

1.4 发酵液的制备

1.4.1 培养液的制备黑木耳粉末（过80目筛）8.00 g、氯化钠2.80 g、葡萄糖2.00 g、蒸馏水480 mL，搅拌均匀即为培养液。取6个三角瓶，每个三角瓶中倒入培养液80 mL，包扎好，121℃高压蒸汽灭菌20 min。吸取培养液2 mL，作为发酵液0 h样品，并测定总糖、还原糖含量，计算多糖含量。

1.4.2 接种将纯培养好的枯草芽孢杆菌制备成菌悬液接入培养液中。

1.4.3 发酵培养将接种好的培养液放入恒温振荡器中进行摇瓶培养，36℃及46℃往复式振摇，150～160次/min，每个温度平行3份，12、24、36、48、60 h测定发酵液总糖、还原糖浓度，计算多糖浓度及枯草芽孢杆菌菌落数。

1.5 总糖含量测定

1.5.1 总糖标准曲线制作葡萄糖为标准品，采用苯酚-浓硫酸法。取干净试管6支并编号，分别吸取0.1 mg/mL标准葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中，再用蒸馏水补足至1 mL，各试管分别加苯酚试剂1.0 mL及浓硫酸5.0 mL，反应液混合均匀，静置10 min，30℃水浴锅中反应20 min。取适量反应液在490 nm处测定吸光度，以葡萄糖浓度（μg/mL）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线[12]。

1.5.2 发酵液中总糖含量测定取0、12、24、36、48、60 h的发酵液2 mL，加水5 mL、浓盐酸1.5 mL，100℃水浴水解3 h，蒸馏水定容至25 mL。吸取上述液0.1 mL于试管中，加蒸馏水0.9 mL，按1.5.1项下操作，490 nm处测定吸光度，计算发酵液中总糖浓度（mg/mL）。总糖浓度=10x/2×25×10-3，式中，x：根据标准曲线计算的糖浓度（μg/mL）。

1.6 还原糖测定

1.6.1 还原糖标准曲线制作以葡萄糖为标准品，采用DNS法。DNS试剂的配制：称取3，5-二硝基水杨酸3.25 g溶于少量水中，移入500 mL棕色容量瓶中，加2 mol/L NaOH溶液162.5 mL，再加入丙三醇22.5 g，摇匀，定容至500 mL，置冰箱备用。取干净试管6支并编号，分别吸取1 mg/mL标准葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中，蒸馏水补足至5 mL，各试管分别加DNS试剂1.5 mL，沸水浴5 min，540 nm波长下测定吸光度，以葡萄糖浓度（μg/mL）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.6.2 发酵液中还原糖含量测定取0、12、24、36、48、60 h的发酵液2.5 mL，加水2.5 mL、DNS 1.5 mL，沸水浴5 min，吸取上述液各1 mL于试管中，分别加蒸馏水19 mL，540 nm波长下测定吸光度，计算发酵液中还原糖浓度（mg/mL）。还原糖浓度=20x/2.5×10-3，式中，x：根据标准曲线计算的糖浓度（μg/mL）。

1.7 发酵液中枯草芽孢杆菌菌落数

取无菌试管6只，各加入无菌生理盐水9 mL，吸取发酵液1 mL注入第一管中，并依次作10倍递增稀释，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6六个浓度，用移液器分别吸取所选定的各种稀释液0.1 mL涂布于无菌琼脂培养皿中，每个浓度做3个平行，36℃及46℃培养60 h，每12 h取出計算菌落数，菌落数乘相应的稀释倍数即得到每毫升发酵液中所含的枯草芽孢杆菌菌落数。

2 结果与分析

2.1 总糖及还原糖的标准曲线

测定总糖的线性回归方程：y=0.0079x+0.119，R2=0.9937；测定还原糖的线性回归方程：

y=0.0034x-0.0764，R2=0.9934。

2.2 总糖和多糖含量变化

图1、图2结果表明，以枯草芽孢杆菌为发酵菌种分别在36、46℃发酵黑木耳培养液，总糖和多糖含量的变化均呈先下降后上升再下降后基本趋于平稳的趋势，且46℃发酵液的总糖及多糖含量明显高于36℃。总糖和多糖含量均在12 h时下降到最低值且低于初始发酵液，表明0～12 h菌体增殖前期大量消耗培养基内速效碳源（葡萄糖），菌体细胞代谢转变成非糖物质的速率远远大于菌体同化成糖的速率；总糖和多糖含量均在24 h时达到高峰且为初始发酵液的两倍左右，表明12～24 h菌体快速增殖，将发酵液中的营养物质同化转变为菌体糖类物质，菌体细胞代谢转变成非糖物质的速率远远小于菌体同化成糖的速率；24～36 h总糖和多糖含量持续下降；发酵36 h后，随发酵时间的延长数值基本保持恒定而略有波动，说明菌体分解代谢消耗的糖分与同化合成糖分的速率基本持平。

2.3 还原糖含量变化

图3结果表明，两种温度条件下发酵液的还原糖含量变化略有不同，两者均在0～24 h呈直线下降趋势，24 h时含量下降至最低峰值，此时培养基的葡萄糖几乎消耗殆尽，对比上述24 h时总糖和多糖含量处于最高峰值，推测此时菌体浓度已达峰值，而此时大量增殖后的菌体细胞处于缺碳状态。24～36 h内发酵液中还原糖含量始终处于极低值，而36～48 h 还原糖含量逐渐升高，表明活性菌体开始降解发酵液中的木耳多糖为还原糖，即当菌体细胞感知培养基内的葡萄糖消耗完全12 h后大量的多糖降解酶开始分泌，转向分解利用迟效碳源（木耳多糖）。46℃发酵后期，还原糖浓度在48 h达峰值后逐渐下降，但36℃发酵后期还原糖浓度逐渐上升，两者的差别说明高温下菌体分解代谢非常旺盛，快速消耗多糖降解后的还原糖然后进入竞争衰亡阶段。

2.3 枯草芽孢杆菌菌落数变化

由图4可见，两种发酵温度菌体数量的总趋势相似，但数值变化幅度差别较大，0～36 h呈先上升后下降、36～60 h呈上升略下降的趋势，其变化趋势与总糖及多糖的变化趋势大体相反。两者发酵24 h时菌体均为高峰值，46℃发酵条件下的菌落数大约高出36℃发酵条件下的2倍，表明高温显著提高了菌体细胞的增殖速率，受发酵液中营养物质的限制大量菌体因竞争缺乏还原糖而死亡，菌体数量下降到一定数量后，逐渐开始分解利用木耳多糖，多糖被降解为还原糖使还原糖浓度升高，为菌体数量的第二次增殖提供碳源。由于低温发酵条件下，活性菌体细胞对物质的代谢

强度低，培养液中的营养物质更多的分配给增殖生长，因此，发酵后期36℃发酵条件下菌落数量高于46℃。

3 结论

以黑木耳子实体为主要成分，以枯草芽孢杆菌为菌种，在相同的初始发酵培养基情况下，分别采用36、46℃两个温度下进行发酵研究。结果表明：低温和高温条件下枯草芽孢杆菌对黑木耳发酵液中糖类的利用及降解性能存在明显差别，46℃高温发酵有利于充分消耗培养液中的还原糖并充分降解黑木耳子实体中的多糖成分，分解子实体细胞壁中大量致密的多糖后使胞内营养物质释放进入发酵液，从而提升发酵液的营养价值。黑木耳子实体蛋白质和多糖含量高，营养价值高，充分降解细胞壁上的糖类可起到破壁释放营养物质的效果，通过发酵试验比较，从降解程度和活性菌体数量两个方面综合考虑，枯草芽孢杆菌发酵黑木耳子实体培养液的最佳工艺为发酵温度46℃，发酵时间24 h。由于黑木耳中还含有大量的蛋白质，因此，今后还应研究枯草芽孢杆菌对黑木耳子实体中蛋白质降解规律的影响因素，来确定其最佳发酵工艺参数，为开发黑木耳为原料的益生菌保健品提供更多的理论参考。

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