胶原蛋白的化学改性方法及其应用的研究进展

赵景华，吴兆明，丁宇宁，刘文文，颜 泽，柯冰冰，沈 萍，胡建恩

(大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁 大连 116023)

胶原蛋白的化学改性方法及其应用的研究进展

赵景华，吴兆明，丁宇宁，刘文文，颜 泽，柯冰冰，沈 萍，胡建恩*

(大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁 大连 116023)

胶原蛋白是动物体内重要的结构蛋白质，因具有生物可降解性、生物相容性、无毒等特性而被广泛应用。本文综述了戊二醛、β-环糊精聚轮烷单醛、丙二酸等交联剂对胶原蛋白进行化学改性的方法研究现状，并介绍了胶原蛋白改性材料在止血、药物运输载体、组织工程支架等方面应用的研究进展。

胶原蛋白；化学改性；交联剂

胶原蛋白(Collagen)主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，约占动物体内蛋白质总量的30%，是结缔组织中极重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体等作用[1]。胶原蛋白的分子量约为300 kDa，由三条分子量相近的肽链组成，三条肽链相互缠绕，通过氢键连接形成稳定的三螺旋结构。三条肽链的交联强度高度可变，这与胶原蛋白的类型、组织、物种、年龄等因素密切相关[2-3]；胶原蛋白中含有丰富的甘氨酸(Gly)、脯氨酸和羟脯氨酸，形成典型的(Gly-X-Y)结构(X、Y代表其他氨基酸)，在每条肽链上都有(Gly-X-Y)重复结构出现，它是形成胶原原纤维的主要结构；其中羟脯氨酸是胶原蛋白的特征氨基酸，它可以形成分子内氢键，对于稳定胶原蛋白的三螺旋结构有着重要作用[4]。胶原蛋白因具有这些独特的结构，而具有生物可降解性、生物相容性、无毒性、低抗原性、细胞黏附等特性[5]。但是胶原蛋白机械强度低、生物降解速率难以控制、易变性等缺点限制了其应用，对胶原蛋白进行改性不仅能提高胶原蛋白的机械强度、热变性温度等特性，还可以有效控制胶原蛋白的降解速率，使改性后的胶原蛋白材料被广泛用于止血、药物运输载体、组织工程支架等方面[6]。本文主要总结了胶原蛋白的化学改性方法及其改性后应用的研究进展。

1 胶原蛋白的化学改性方法

与物理改性方法相比，化学改性方法在调整和控制胶原蛋白的结构和性质，提高胶原蛋白的拉伸强度、柔韧性等机械性能，控制胶原蛋白的生物降解速率，提高胶原蛋白的热稳定性等方面效果更显著[7]。胶原蛋白的化学改性以交联改性为主，主要的交联剂包括醛类、二羧酸类、京尼平、碳化二亚胺、柠檬酸衍生物、壳聚糖和聚乙烯醇等。

1.1 醛类

戊二醛是最早使用的一种交联剂，它具有水溶性、双官能团、价格低等优点[8]。胶原蛋白中的伯氨基能与戊二醛的两个醛基发生反应形成希夫碱，将胶原蛋白分子以五元环的形式连接起来(图1)[9]。曹建等[10]研究了戊二醛改性胶原蛋白的最佳条件：pH8、戊二醛浓度2%、反应时间1.5 h、温度60℃，在此条件下，胶原蛋白的乳化性和乳化稳定性都最好。但是将不同戊二醛浓度(0.1%～1.0%)改性的胶原蛋白植入到大鼠皮下，会对大鼠皮肤产生不同程度的侵蚀，大鼠皮肤会出现炎症反应和细胞毒性，并且周围组织会出现一定程度的钙化[11]。因此，戊二醛常用其他醛类物质替代。

Sa Liu等[12]成功合成了一种新型醛类交联剂，即β-环糊精聚轮烷单醛，它能与胶原蛋白进行交联且无显色反应，胶原蛋白的伯氨基与β-环糊精聚轮烷单醛的醛基反应生成希夫碱。经β-环糊精聚轮烷单醛改性后的胶原蛋白热变性温度为81.6℃，交联度高达87.1%，远高于相同浓度的戊二醛改性的胶原蛋白的热变性温度和交联度。在细胞毒性研究实验中发现经β-环糊精聚轮烷单醛改性后的胶原蛋白无细胞毒性。

1.2 二羧酸类

常用的交联剂与胶原蛋白交联主要以共价键作用为主，研究表明在胶原蛋白改性时，仅共价键占主导地位，会限制胶原蛋白材料所需的机械强度和生物相容性等性能，二羧酸可以通过非共价键作用与胶原蛋白交联，使胶原材料的拉伸强度、断裂伸长率等机械性能显著提高，生物相容性显著增强[13]。

丙二酸是一种简单的二羧酸，无毒且价格低廉，主要通过非共价键作用与胶原蛋白交联[14]。Tapas Mitra等[15]研究了丙二酸与胶原蛋白的交联机理，如图2所示，胶原蛋白上赖氨酸的氨基与丙二酸的羧基通过质子交换和离子间相互作用形成了一种新型三维支架材料。胶原蛋白与丙二酸交联的最佳条件为：胶原蛋白为0.5%、丙二酸为0.2%，在此条件下制备的支架材料的拉伸强度(7.9 MPa)、断裂伸长率(11.8%)、杨氏模量(66.0 MPa)等机械强度达到最大，交联度为78%，变性温度达到128℃，经扫描电子显微镜(SEM)观察其结构高度多孔。噻唑蓝(MTT)试验结果表明该支架材料无细胞毒性且具有良好的生物相容性，适合用于组织工程研究。Tapas Mitra先后还研究了乙二酸[14]、丁二酸[16]、庚二酸[17]与胶原蛋白的交联作用，结果表明经二元羧酸改性后胶原蛋白的拉伸强度、断裂伸长率等机械性能、热稳定性、生物相容性等都得到了显著的改善。

1.3 京尼平

京尼平是从栀子果实中提取的化合物，它具有羟基、酯键等多种活性基团，可直接与氨基酸或蛋白质反应[18-19]。胶原蛋白与京尼平的反应机理如图3所示，京尼平先与胶原蛋白的氨基作用，生成具有环烯醚萜的氮化物，经过脱水作用得到芳香族的单体，再经过自由基反应的二聚作用，产生分子内和分子间环状的交联结构[20]。

胶原蛋白是细胞生长的支架材料，具有促进细胞黏附和诱导细胞生长分化的作用，被广泛用于组织工程学研究[21-22]。Xiujie Zhang等[23]以京尼平作为交联剂与Ⅰ型胶原蛋白交联制备支架材料，并研究了两者交联的最佳条件：京尼平浓度为0.3%、交联温度为37℃，在此条件下制备的支架材料经SEM观察其形态结构与纯胶原蛋白相比发生了改变，由片状结构变为网状结构；同时其溶胀率、抗压强度、降解速率、稳定性与纯胶原蛋白相比都得到了显著的改善；MTT实验结果表明该支架材料具有良好的生物相容性且细胞毒性低。王刚等[24-25]将人脂肪间充质干细胞接种于京尼平改性的胶原蛋白支架材料上，细胞在该支架上生成了成熟脂肪样细胞，表明京尼平对人脂肪间充质干细胞的毒性低，且京尼平交联的胶原蛋白与该细胞具有良好的生物相容性。

1.4 碳化二亚胺

碳化二亚胺(EDC)属于酰胺型交联剂[26]。EDC与胶原蛋白的反应机理如图4所示，EDC可以促进胶原蛋白的谷氨酸或天冬氨酸的羧基与氨基连接形成酰胺键，EDC本身不成为实际交联的一部分，而是形成可溶于水的脲衍生物，可以通过冲洗除去，避免引入有毒物质[27]。

为提高EDC的交联效率，EDC常与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)联用。王迎军等[28]用EDC/NHS作为交联剂，与胶原蛋白交联，研究表明改性后胶原蛋白的热稳定性、形态稳定性增强，抗酶解能力显著提高，经SEM观察其结构更加紧密有序。Gloria等[29]分别用EDC/NHS、戊二醛、京尼平作为交联剂，制备胶原蛋白支架材料，比较不同交联剂对胶原蛋白结构和性能的影响。将交联后的胶原蛋白放入磷酸盐缓冲液(PBS)中1、2、3个月后发现戊二醛交联的胶原蛋白纤维结构很快消失，京尼平交联的胶原蛋白在2～3个月后纤维结构完全消失，EDC/NHS交联的胶原蛋白在浸泡3个月后仍能保持完整的纤维结构，说明EDC/NHS能提高胶原蛋白的结构稳定性。将人骨髓间充质干细胞植入到胶原蛋白支架上，发现EDC/NHS交联的胶原蛋白支架材料无细胞毒性且具有良好的细胞相容性。

1.5 柠檬酸衍生物

Tetsushi等[30]用N-羟基琥珀酰亚胺修饰柠檬酸的三个羧基制备了一种新型交联剂，即柠檬酸衍生物(CAD)。CAD中有三个活性酯基，可以与胶原蛋白中赖氨酸或羟基赖氨酸的氨基反应形成酰胺键(图5)。细胞毒性研究结果表明，经CAD改性后，胶原蛋白材料的细胞毒性比戊二醛低10倍；将该材料植入到老鼠皮下7 d内被完全降解且无炎症反应。

1.6 壳聚糖

壳聚糖是天然阳离子多糖，无毒，具有生物相容性、生物可降解性、抗菌活性和止血等性能，可应用于手术缝合线、药物运输载体和伤口敷料等方面[31]。胶原蛋白与壳聚糖之间通过氢键和静电作用在氨基、羟基等基因之间形成交联，使胶原-壳聚糖复合材料形成三维立体结构[32]。

陈达佳等[33]以胶原蛋白和壳聚糖为原料制备了可食用复合膜，研究了胶原蛋白与壳聚糖的质量比、甘油添加量、热处理温度及时间等工艺参数对可食用复合膜性能的影响。结果表明，在胶原蛋白与壳聚糖质量比6∶4、甘油添加量20%、热处理温度70℃、热处理时间30 min的条件下，得到的复合膜表面光滑无气泡，拉伸强度达到22.0 MPa，断裂伸长率达到127.4%。Mingmao Chen等[5]用冷冻干燥法制备了胶原蛋白-壳聚糖止血海绵，研究了胶原蛋白与壳聚糖的最佳比例、止血海绵的性质及结构。结果表明，胶原蛋白与壳聚糖最佳比例为1∶0.25；SEM观察止血海绵呈高度多孔的网状结构；MTT实验和体外溶血实验表明止血海绵无细胞毒性，无溶血现象；止血实验表明该止血海绵与医用纱布、纯胶原蛋白相比，止血时间短且失血量少。

1.7 聚乙烯醇

聚乙烯醇是一种水溶性的高分子聚合物，对人体无毒副作用，具有生物可降解性和生物相容性，其力学性能优良，化学性质稳定，常被用做软骨移植材料、烧伤敷料、药物运输载体等[34]。聚乙烯醇中含有大量的羟基，可以与胶原蛋白中的氨基通过氢键连接形成更稳定的大分子物质。

李沁华等[35]以胶原蛋白、聚乙烯醇、透明质酸为原料，制备三维多孔的复合材料，考察了三者之间的比例对复合材料性质的影响。研究表明，三者(聚乙烯醇∶胶原蛋白∶透明质酸)质量比为15∶4∶0.24时，复合材料的综合性能最佳，具有较高含水率(58.0%～81.3%)和膨胀率(1.5～4.6倍)；经SEM观察呈互相交错的多孔结构，有利于构建组织工程支架材料。Asran等[36]以聚乙烯醇、胶原蛋白、羟基磷灰石为原料，三者之间通过氢键连接形成一种新型三维支架材料，该支架材料孔隙率为49.5%；具有较强的拉伸强度(1.0 MPa)和弹性模量(11.1 MPa)；透射电镜观察该支架材料与骨具有相似的纳米结构，有望作为骨移植材料应用于组织工程。

2 胶原蛋白在生物医学上应用的研究进展

2.1 止血材料

胶原蛋白因具有生物相容性、血液可吸收性、低免疫原性等性能而被广泛用作止血材料。胶原蛋白止血材料具有多孔网状结构，与出血创面接触时，利用其毛细作用迅速吸附伤口处血液，促使血小板凝聚，产生凝血酶，而凝血酶通过再催化过程将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，使血液凝固，达到止血的目的[37]。

徐志霞等[38]以碳化二亚胺为交联剂，制备的胶原蛋白止血海绵能有效地缩短创面出血时间，减少出血量，其止血效果优于市售明胶海绵。程玮璐等[39]利用氧化再生纤维素(ORC)作为胶原蛋白海绵中的填料，制备的止血海绵与未添加ORC的胶原海绵相比，其力学性能更好，止血时间更短，植入动物体内28 d后被完全降解且对周围组织无影响。Kevin等[40]用聚乙二醇修饰胶原蛋白制成胶原蛋白止血膜，发现该膜在猪肺动脉大量出血时具有很强的组织粘附性和止血特性。Jyh-Ping等[41]通过静电纺丝技术制备了胶原蛋白-壳聚糖-聚环氧乙烷纳米纤维膜，该纤维膜无细胞毒性，且止血效果强于医用纱布和市售明胶海绵。

2.2 药物释放载体材料

胶原蛋白是一种结缔组织蛋白，具有生物相容性、生物可降解性和低免疫原性，可以作为理想的药物载体材料[42]；可以通过控制胶原蛋白的结构来实现对药物的缓慢释放，将胶原蛋白交联成高度多孔的网状结构，使其机械强度提高，载药量增加，生物降解速率减慢，以此来延长药物的释放时间[43]。

任建东等[42]以胶原蛋白微条作为药物释放载体，发现当水分渗入到微条中时，药物的溶解和胶原蛋白的膨胀同时进行，药物以一种溶解状态存在于胶原蛋白中，以扩散方式逐步释放。丁时踽等[44]发现以胶原蛋白作为药物释放载体时，引入以壳聚糖为包囊的药物微粒，可明显增强其缓释作用，更有效地延长药物在植入部位存留的时间。

2.3 组织工程支架材料

组织、器官缺损的修复和功能的重建是人们面临的巨大挑战，组织工程学的发展为组织的再生和重建提供了一项新的技术。胶原蛋白常被作为组织工程支架材料，从体内提取种子细胞并通过体外扩增后接种到胶原蛋白支架上，经过体外培养形成功能化组织后再植入体内，可修复相关组织缺损[45]。

2.3.1 皮肤替代物

皮肤损伤严重时会导致死亡，特别是烫伤或烧伤皮肤很难自发修复。胶原蛋白常被用于培养皮肤细胞，作为皮肤损伤治疗的载体[46]。Lie Ma等[47]以胶原蛋白为原料，制备的真皮替代物不仅可以促进成纤维细胞再生、增殖和分化，还能加快体内血管的形成，并且产生的皮肤结构与真皮结构极为相似。刘学旭等[48]以胶原蛋白、葡甘聚糖(葡萄糖和甘露糖的聚合物)和硫酸软骨素为原料制成的复合膜具有促进皮肤结构再生的能力，并且能防止创口出血和感染，机体对其无明显的免疫排斥反应。Mehmet等[49]用胶原蛋白-弹性蛋白基质(由天然的结构完整的Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ型胶原原纤维和弹性蛋白组成)作为人工皮肤，对15个面部严重烧伤(平均烧伤面积为75%)的儿童进行皮肤移植，结果表明，移植的人工皮肤在血管分布、弹性、柔韧性、质地和颜色等方面均接近正常皮肤。

2.3.2 骨移植材料

胶原蛋白是骨细胞外基质的重要组成成分，骨组织工程的发展为骨缺损修复提供了新的技术，宋芹等[50]以胶原蛋白为原料，添加纳米羟基磷灰石和丝素蛋白，制备的胶原蛋白复合支架材料有利于成骨细胞的黏附、生长，且对细胞、组织无毒副作用；其压缩应变及弹性模量等指标均适于骨组织材料的构建。Jason等[51]制备的可用于3D打印的胶原蛋白支架材料具有良好的生物相容性和生物可降解性，将其植入到股骨缺损的小鼠体内9周后，发现该支架材料具有骨传导性，并且促进了新骨的生长，有望用于大面积骨组织缺损的修复。

2.3.3 角膜移植材料

胶原蛋白约占眼角膜干重的70%，胶原纤维在眼角膜中以规整有序的结构排列[52-53]。角膜受损后很难修复或重建，有研究发现将体外培养扩增的正常角膜干细胞植入胶原蛋白支架上，形成组织工程人工角膜，能修复受损角膜[54]。袁晓龙等[55]首次利用鱼皮胶原蛋白制备三维角膜载体支架，所制备的角膜支架透明度与天然猪角膜相比无显著差异，且结构呈现出均匀的网格状，适于非转染人角膜基质细胞的顺利迁入且与该细胞有良好的生物相容性，有望作为载体支架用于人工角膜的体外构建。Mehrdad等[56]将胶原蛋白-壳聚糖混合水凝胶作为角膜移植材料，该材料具有良好的细胞亲和性和生物可降解性，将该材料植入到猪眼内12个月后，成功再生了角膜上皮细胞、基质细胞及神经细胞，并且比人角膜的光学清晰度高，可以作为角膜的替代物修复受损角膜。

3 展望

通过改性获得的力学强度高、生物相容性好的胶原蛋白材料已被应用于止血、药物载体、组织工程等方面。但是目前常用的改性交联剂如戊二醛等，存在细胞毒性等问题，会对皮肤或组织产生一定影响，如皮肤炎症、组织钙化等。所以合成新型交联剂引起了人们的广泛关注，通过合成无毒且具有不同活性官能团的新型交联剂来制备胶原蛋白材料，不仅可以获得安全且交联效率高的胶原蛋白材料，还可以弥补胶原蛋白原有的不足。目前合成的新型交联剂有β-环糊精二醛、β-环糊精聚轮烷多醛、柠檬酸衍生物等。虽然胶原蛋白改性材料在医用生物材料、化妆品、食品材料等方面的研究较为成熟，但离大规模工业化生产还有一定的距离，如何将成熟的理论研究与实际生产相结合是工业化生产亟待解决的问题。

此外，我国是渔业大国，在水产品加工中会产生大量的副产物，而这些副产物中含有丰富的胶原蛋白，从水产品副产物中提取胶原蛋白，不仅安全、纯度高，而且可以实现水产品的高附加值。但水产来源的胶原蛋白与猪、牛等来源的相比，其拉伸强度、断裂伸长率等机械强度更低、更易变性，因此寻找合适的方法对其进行改性研究获得力学强度高、热稳定性高、生物相容性好的胶原蛋白材料将是胶原蛋白研究的新方向。

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Research progress on chemical modification and application of collagen

ZHAO Jinghua，WU Zhaoming，DING Yuning，LIU Wenwen，YAN Ze，KE Bingbing，SHEN Ping，HU Jian’en*

(College of Food Science and Engineering，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China)

Collagen is an important structural protein in animal body.It is widely used because of its biodegradability，biocompatibility and nontoxicity.In this paper，the research progress of the chemical modification of collagen by glutaraldehyde，β-cyclodextrin，polyrotaxane aldehyde，malonic acid and other crosslinking agents was reviewed，and the application of collagen modified materials in hemostatic，drug delivery carrier and tissue engineering scaffold was introduced.

collagen；chemical modification；crosslinking agent

2016-12-06

黄渤海区域主要水产品加工副产物高值化利用产业化关键技术集成及示范(201505030).

赵景华(1990-)，女，河南，硕士研究生，研究方向为农产品加工与贮藏工程.Tel：18840937265.E-mail：lzjh90@126.com

胡建恩(1962-)，男，教授，博士，研究方向为食品科学与海洋资源利用.Tel：13898465160.E-mail：huje@dlou.edu.cn

TS254.9

A

1006-5601(2017)02-0147-10

赵景华，吴兆明，丁宇宁，等.胶原蛋白的化学改性方法及其应用的研究进展[J].渔业研究，2017，39(2)：147-156.