人参皂苷 Rg1对创伤后应激障碍大鼠行为学变化和海马神经元自噬的影响*

吴仲敏， 程正文， 倪桂莲， 邵爱民， 崔 融△

(1台州学院医学院解剖学教研室，浙江 台州 318000； 2临海市第一人民医院神经内科， 浙江 临海 317000)

人参皂苷 Rg1对创伤后应激障碍大鼠行为学变化和海马神经元自噬的影响*

吴仲敏1, 2， 程正文2， 倪桂莲2， 邵爱民2， 崔 融2△

(1台州学院医学院解剖学教研室，浙江 台州 318000；2临海市第一人民医院神经内科， 浙江 临海 317000)

目的： 研究人参皂苷 Rg1 对创伤后应激障碍(PTSD)大鼠行为学变化和海马神经元自噬的影响。方法: 将SD大鼠随机分为5组：对照组；模型组；人参皂苷Rg1低、高剂量(20和40 mg/kg)组；阳性药(氟西汀)组。采用连续单一应激和足底电击相结合方法制备 PTSD 模型，人参皂苷 Rg1 低、高剂量组和阳性药组分别连续灌胃给药 21 d，对照组及模型组每日等体积生理盐水灌胃。造模前后各组大鼠分别作旷场试验和僵立行为测定，Nissl染色法观察海马神经元形态结构变化，免疫荧光双标记法观察海马 beclin 1和LC3 阳性神经元，Western blot法检测海马 beclin 1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ 蛋白水平以及 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率。结果: 与对照组相比，模型组大鼠在旷场箱内活动次数减少，木僵率提高,海马神经元排列疏松，出现空泡样结构，伴有不同程度的细胞固缩,beclin 1和LC3 阳性神经元明显增多,beclin 1 蛋白水平增高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率增大。人参皂苷 Rg1 低、高剂量组大鼠在旷场箱内活动次数增加，木僵率下降，海马神经元空泡样结构减少，细胞数量增多，beclin 1和LC3 阳性神经元减少，beclin 1 蛋白水平下降，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率减少。其中，人参皂苷Rg1高剂量组较Rg1低剂量组上述改变更为明显。结论: PTSD 模型大鼠存在明显的海马神经元自噬增强和行为学异常表现。人参皂苷 Rg1 对 PTSD 症状有明显改善作用，其机制可能与抑制海马神经元异常自噬活动有关。

创伤后应激障碍； 人参皂苷 Rg1； 海马； 自噬

创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder，PTSD)是指由突发性、威胁性或灾难性生活事件导致长期持续存在的精神障碍[1]。其临床表现以再度体验创伤为特征，并伴有情绪的易激惹和回避行为[2]。近年来，随着严重自然灾害、重大传染病流行和突发事件的不断发生，PTSD 呈明显上升趋势[3]，对其发病机制的研究已成为目前的研究热点之一。已有的研究认为，PTSD 的发生与海马神经元萎缩、凋亡、异常自噬以及突触萎缩等改变相关联[4-5]，其中5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)系统在PTSD海马的病理变化中扮演重要角色，5-HT系统功能低下被认为是PTSD的主要病因[6-7]，但其确切的发病机制尚不明了。人参皂苷 Rg1(ginsenoside Rg1)是人参的主要活性成分，具有神经保护和神经营养作用[8]，能促进神经发生,提高免疫功能[9]，但其对PTSD是否有干预作用，目前尚未见文献报道。本研究通过连续单一应激(single prolonged stress)和足底电击(foot stock)相结合的方法制备 PTSD 大鼠模型[10]，观察人参皂苷 Rg1对PTSD大鼠行为学变化和海马神经元自噬的影响，探讨人参皂苷 Rg1对PTSD大鼠的干预作用及机制。

材 料 和 方 法

1 实验仪器、药物及试剂

行为学自动观察分析系统：采用Noldus行为学研究设备，含计算机、摄像监控及Observer、EthoVision等分析软件。人参皂苷 Rg1 由上海同田生物技术有限公司提供；盐酸氟西汀分散片，每片含盐酸氟西汀相当于氟西汀 20 mg，由Lilly生产；兔抗beclin 1 抗体和兔抗LC3抗体均购自Abcam；放射免疫沉淀实验(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液和二喹啉甲酸(bicinchonic acid，BCA)蛋白质定量试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。

2 实验动物及分组

清洁级健康成年雄性 SD 大鼠，体重(200±20)g，由浙江大学实验动物中心提供，动物合格证编号为SYXK-2012-0178；适应性饲养 7 d后，进行旷场实验，剔除水平和垂直活动总分低于10的大鼠。而后采用完全随机设计，将旷场实验合格的大鼠50只，随机分成 5 组，即对照组、模型组、阳性药(氟西汀)组和人参皂苷 Rg1 低、高剂量组，每组 10 只。

3 实验方法

3.1 PTSD 模型的建立及干预方法 大鼠适应性单笼饲养 7 d后，除对照组外，其余大鼠均采用连续单一应激和足底电击相结合方法制备PTSD模型：先给予单一连续应激(禁锢 2 h，强迫游泳 20 min，乙醚麻醉至昏迷)，30 min后大鼠置于电击箱(40 cm×30 cm×25 cm)适应196 s后给予 15 个循环周期(电流0.8 mA，持续 10 s，间歇 10 s)的足底电击。对照组大鼠放入相同的电击箱10 min，不给予足底电击。电击结束后把动物放回鼠笼静养。饲养条件为：22～25 ℃，昼夜节律，自由饮水摄食。实验期间每天9:00予阳性药组大鼠灌服氟西汀，氟西汀的用药剂量为10 mg/kg；人参皂苷低、高剂量组大鼠分别灌服人参皂苷 Rg1 20和40 mg/kg[11-12]，均溶于生理盐水中；对照组及模型组每日等体积生理盐水灌胃。各组灌胃容积均为5 mL/kg，连续给药 21 d后测试实验效应。

3.2 旷场实验检测大鼠焦虑水平 连续给药 21 d后分别取各组大鼠进行旷场实验，实验在安静环境下进行，采用特制的旷场箱(100 cm × 100 cm × 40 cm)，由浙江大学实验动物中心提供，箱体为立方形，内侧壁及底面为灰色，用黑线划分为 25 格，每格形制均为 20 cm × 20 cm。沿侧壁的格称为外周格(16 个周边正方形)，其余为中央格(9 个中心正方形)。正中格正上方安置摄像头。将动物放入箱内底面正中格内，同时用自动观察分析系统摄像，观察大鼠在5 min内穿越格数(4爪均进入方格才记数，为水平运动得分)和后肢直立次数(2 前爪腾空或攀附墙壁，为垂直运动得分)。每只大鼠仅进行1次测定。每一次测定完毕后彻底清洁方箱内壁及底面再进行下一只观察，以免上次动物余留的信息(如动物的大、小便和气味)影响下次测试结果。

3.3 僵立行为测试大鼠恐惧表达 旷场实验结束后对各组大鼠进行僵立行为测试，将大鼠置于原造模电击箱中，测 4 min 内的僵立行为，每 10 s测1次，表现为僵立行为时为阳性，所得阳性次数之和占总次数的百分比为木僵率。僵立行为是一种普遍见于啮齿类动物的防御行为，表现为刻板式的蹲伏姿势，可以有一定程度的摇摆，大鼠外观除呼吸运动以外其余的肌肉运动均消失，是大鼠恐惧表达的一种行为方式。

3.4 Nissl染色法观察海马神经元形态结构 行为学测试完毕后，随机抽取各组大鼠5 只，经腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)深麻醉,经升主动脉灌注4%多聚甲醛(0.1 mol/L PB，pH 7.4)内固定，固定后取出脑块，再固定 2 h，Leica 恒冷箱冰冻切片机连续切片，切片梯度乙醇降至水，0.1% 焦油紫染色 5～10 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，光镜下观察海马神经元形态结构改变。

3.5 免疫荧光双标记法检测海马组织beclin 1 和 LC3 阳性神经元 分别取各组大鼠固定后的脑块，连续冰冻切片，片厚20 μm ，隔2取1，分为3套切片，依次裱贴于经明胶处理的载玻片上，切片入 PBS 液洗涤 3 遍，80%甲醇(含0.03%过氧化氢)溶液处理30 min，然后滴加抗体稀释液4 ℃冰箱内过夜。其中第1套切片进行 NeuN 和 beclin 1 双标记染色，首先切片入兔抗 beclin 1 (1∶1 000)抗体中孵育48 h；再在生物素化的羊抗兔 IgG(1∶200， Vector)中孵育 24 h；然后在avidin结合的 FITC(1∶200， Vector)中孵育 6 h，经 PBS 液洗涤 3 遍后，再次将切片置于鼠抗 NeuN(1∶1 000，Abcam)抗体中孵育48 h；用生物素化的羊抗鼠 IgG(1∶200， Vector)孵育 24 h；在avidin结合的 Texas-red(1∶200， Vector)中孵育 6 h。以上步骤均在 4 ℃ 避光条件下进行， 经 PBS 甘油(1∶1)封片。第2套切片用于 NeuN 和 LC3双标记染色,染色步骤同上。第3套切片作为阴性对照(用 PBS 液替代 I 抗，其余实验步骤不变)。

在激光共聚焦显微镜下分别观察红色 Texas-red 标记(细胞核)的 NeuN 阳性神经元中绿色 FITC 标记(细胞浆)的 beclin 1和LC3。阳性细胞记数：随机抽取每个海马组织双标记阳性的 4 张切片，200 倍视野下用显微镜目镜测微尺(上海光学仪器厂)计数单位面积内(mm2)beclin 1和 LC3 阳性细胞数量的平均值。

3.6 Western blot法检测海马组织beclin 1 和 LC3蛋白水平 行为学测试完毕后，另取各组大鼠5只，经腹腔注射戊巴比妥钠(60 mg/kg)深麻醉,大鼠断头速取新鲜海马组织，分别称量各组海马组织 100 mg，按比例加入RIPA 裂解液，冰浴充分研磨，离心取上清为海马组织总蛋白，参照 BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，按30 μg 蛋白量上样，应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，湿法转膜，5% 脱脂牛奶室温封闭2 h，加入目标蛋白 I 抗(1∶1 000)或β-actin I 抗(1∶500)，4 ℃ 反应过夜。次日洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的 II 抗(1∶1 000， Vector)，室温孵育 1 h，洗膜后加 ECL 显色剂，胶片曝光显影，采用ImageJ 软件分析 Beclin 1 和LC3 蛋白表达情况。

4 统计学处理

全部资料用SPSS 19.0软件进行统计分析。各组数据以均数±标准差(mean±SD)表示，两组间比较采用t检验, 多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用 LSD 检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 行为学实验指标改变明显

1.1 人参皂苷 Rg1作用后PTSD大鼠旷场箱内垂直和水平运动得分增加 如表1所示，给予不同的干预因素21 d 后，5组间垂直运动(直立次数)和水平运动均有显著差异(P<0.01)。其中模型组大鼠在垂直运动、水平运动方面均明显低于对照组(P<0.01)；与模型组相比，人参皂苷 Rg1 低、高剂量组大鼠垂直运动和水平运动得分均显著增加(P<0.05)，氟西汀组的垂直运动和水平运动得分也显著高于模型组(P<0.01)。

1.2 人参皂苷 Rg1作用后PTSD大鼠木僵率降低 5组间僵立行为百分率均有显著差异(P<0.01)。其中与对照组比较，模型组大鼠木僵率明显提高(P<0.01)；与模型组相比，人参皂苷 Rg1 低、高剂量组大鼠木僵率显著降低(P<0.05)，氟西汀组的木僵率也显著低于模型组(P<0.01)，见表 1。

表1 各组大鼠旷场行为和僵立行为测试结果比较

Table 1.Comparison of the locomotor activity in open-field test and the stiff rate in stiff behavior test among groups (mean±SD.n=10)

GroupOpen-fieldtestStiffbehaviortestHorizontalmovementVerticalmovementRateofstiffbehavior(%)Control57.6±6.312.4±1.76.8±1.3PTSD28.8±3.5**3.8±0.5**52.6±8.6**Rg1-20mg/kg38.4±7.5△4.8±0.5△33.6±8.3△Rg1-40mg/kg47.8±3.7△△7.3±0.5△△23.5±4.2△△Fluoxetine53.6±5.8△△9.2±1.2△△18.4±3.3△△

**P<0.01vscontrol group;△P<0.05，△△P<0.01vsPTSD group.

2 人参皂苷 Rg1作用后PTSD海马神经元形态结构趋于完整

如图1所示，对照组海马神经元排列整齐，细胞形态结构完整，模型组海马神经元排列疏松，出现空泡样结构，伴有不同程度的细胞固缩；人参皂苷 Rg1 组较之模型组海马神经元排列趋向整齐，细胞结构日趋完整，空泡样结构不断减少，细胞数量也有所增加，尤以高剂量组改变明显；氟西汀组海马神经元的数量、排列和细胞结构与人参皂苷 Rg1 高剂量组相似。

Figure 1.The distribution of hippocampal neurons in rats (Nissl staining).Scale bar=50 μm.

图1 Nissl染色观察大鼠海马神经元的形态与分布

3 人参皂苷 Rg1作用后PTSD海马beclin 1 和 LC3 阳性神经元减少

激光共聚焦显微镜下观察海马荧光双标记阳性神经元，经统计学检验，5组间beclin 1和LC3 阳性神经元均有显著差异，模型组显著高于对照组(P<0.01)，人参皂苷 Rg1 高剂量组和氟西汀组的beclin 1 和 LC3 阳性神经元明显少于模型组(P<0.01)，略高于对照组，但无显著差异,见图2、表2。

Figure 2.Distribution of beclin 1 and LC3 positive neurons in hippocampus of the rats (immunofluorescence labeling). Scale bar=50 μm.

图2 免疫荧光标记大鼠海马beclin 1和LC3阳性神经元的形态与分布

表2 各组大鼠海马beclin 1标记阳性和LC3标记阳性神经元的数量

Table 2.Numbers of beclin 1-positive neurons and LC3-positive neurons in rat hippocampus (mm-2. Mean±SD.n=5)

GroupBeclin1-positiveneuronsLC3-positiveneuronsControl4.5±1.15.8±1.3PTSD45.6±7.2**57.6±10.1**Rg1-20mg/kg32.4±4.5△33.6±5.3△Rg1-40mg/kg21.8±3.7△△23.5±4.2△△Fluoxetine11.2±2.2△△11.4±3.3△△

**P<0.01vscontrol group;△P<0.05 ，△△P<0.01vsPTSD group.

4 人参皂苷 Rg1作用后PTSD海马神经元自噬水平减低

海马组织Western blot结果见图3、表3，经统计学检验，5组间beclin 1 和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均有显著差异。模型组beclin 1 蛋白水平和 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显高于对照组(P<0.01), 人参皂苷 Rg1 高剂量组的 beclin 1 蛋白水平和 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显低于模型组(P<0.01)，略高于对照组；人参皂苷Rg1高剂量组的beclin 1蛋白水平和 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均低于低剂量组(P<0.05)。

讨 论

PTSD的临床表现主要为对创伤事件的病理性重现、对创伤相关线索回避、持续性高唤醒，以及对创伤经历的选择性遗忘和情感麻木等。本研究采用连续单一应激和足底电击相结合方法制备 PTSD 大鼠模型，通过旷场行为检测和僵立次数变化来验证模型制备效果，实验结果表明连续单一应激+足底电击应激能较好地诱发大鼠多种 PTSD 样精神和行为异常表现,显示本模型为研究 PTSD 发病机制及药理机制的较理想的动物模型。

Figure 3.The changes of beclin 1 and LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ protein levels in the hippocampus of the rats determined by Western blot.

图3 Western blot检测大鼠海马beclin 1和LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白水平的变化

表3 各组大鼠海马beclin 1蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平比值的定量结果

Table 3.Protein quantification of beclin 1 and the expression ratio of LC3-Ⅱ to LC3-Ⅰin rat hippocampus (Mean±SD.n=5)

GroupBeclin1LC3-Ⅱ/LC3-ⅠControl1142.5±655.10.218±0.013PTSD2545.6±877.2**0.676±0.021**RG1-20mg/kg1832.4±754.5△0.433±0.023△RG1-40mg/kg1311.8±683.7△△0.265±0.018△△Fluoxetine1278.2±852.5△△0.211±0.015△△

**P<0.01vscontrol group;△P<0.05，△△P<0.01vsPTSD group.

人参皂苷 Rg1是人参的标志性成分，对老年痴呆、脑缺血、帕金森病等神经退行性疾病有一定改善作用，它还能够增加神经发生和突触可塑性，具有重要的神经保护作用[13],而人参皂苷 Rg1 是否具有抗PTSD作用未见报道。本研究通过连续单一应激+足底电击应激刺激制备PTSD大鼠模型，依据王巧云等[11]和李彦东等[12]的灌胃剂量与方法，观察人参皂苷 Rg1抗PTSD的活性，并探讨人参皂苷 Rg1抗PTSD的机制。旷场实验和僵立行为测试结果发现，人参皂苷 Rg1 组大鼠的穿格次数和直立次数显著增加，僵立次数明显减少，说明人参皂苷 Rg1可以改善大鼠的PTSD 样行为，对PTSD具有明显调节作用。 PTSD的海马组织存在明显萎缩、体积缩小现象[14-15]，海马作为中枢边缘系统的主要结构，与情绪、记忆以及应激联系密切，海马损伤会导致海马相关的空间记忆、应激、情感控制和对新奇事物的反应处理等过程的缺陷[16]。本研究发现 PTSD 模型大鼠海马神经元排列疏松，出现空泡样结构，伴有不同程度的细胞固缩；人参皂苷 Rg1 低、高剂量组海马神经元数量均有不同程度增加，空泡样结构明显减少；阳性药氟西汀组海马神经元在数量、排列和结构方面的变化均与人参皂苷 Rg1 高剂量组相似。这说明人参皂苷 Rg1和氟西汀均具有促进海马神经元增殖和减缓PTSD海马病理进程的作用。

有研究报道PTSD大鼠的海马神经元存在过度自噬[17]，因此过度自噬可能是海马体积缩小的重要原因。临床上推荐的抗PTSD一线药物氟西汀是典型的选择性5-HT再摄取抑制剂，新近的研究认为其作用机制与抑制海马神经元过度自噬，改善海马神经元突触重塑性有关[18]。Beclin 1是调控自噬的关键因子,也是自噬体的标志分子之一[19]；LC3则是自噬的关键蛋白，分为Ⅰ型和Ⅱ型,采用蛋白印迹法测定LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值是一种评价自噬活性简单易行的办法[20]，本研究首先采用免疫荧光双标记法标记各组大鼠海马beclin 1和LC3阳性神经元，在激光共聚焦显微镜下观察beclin 1和LC3阳性神经元，并采用蛋白印迹法检测beclin 1 蛋白水平和 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，结果显示PTSD大鼠beclin 1、LC3 阳性神经元明显增多，海马beclin 1 蛋白水平显著增高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显增大，提示自噬参与了 PTSD的病理进程。实验同时发现，人参皂苷 Rg1 低、高剂量组和氟西汀组大鼠海马beclin 1和LC3 阳性神经元均不断减少，beclin 1 蛋白水平和 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均有不同程度下降，其中，人参皂苷 Rg1 高剂量组较之 Rg1 低剂量组上述改变更为明显。由此，可以认为人参皂苷 Rg1是通过减缓PTSD大鼠海马神经元的异常自噬活动而产生良好的抗PTSD作用，这为临床用药开拓了广阔前景。

综上所述，本研究通过成功复制PTSD大鼠模型，探讨人参皂苷 Rg1对PTSD大鼠行为学和海马神经元自噬的影响，实验结果表明人参皂苷 Rg1与阳性药氟西汀均具有调节大鼠PTSD样行为作用，且二者的抗PTSD作用机制均与其抑制PTSD大鼠海马神经元异常自噬以及促进海马神经元增殖作用有关。据此认为，人参皂苷 Rg1对PTSD具有一定的治疗作用，至于何等剂量的人参皂苷 Rg1作用最为理想以及人参皂苷 Rg1抗PTSD作用的确切机制有待进一步研究。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Effect of ginsenoside Rg1 on behavioral changes and autophagy of hip-pocampal neurons of rats with post-traumatic stress disorder

WU Zhong-min1，2, CHENG Zheng-wen2， NI Gui-lian2, SHAO Ai-min2, CUI Rong2

(1DepartmentofAnatomy,TaizhouUniversitySchoolofMedicine,Taizhou318000,China;2DepartmentofNeurology，FirstPeople’sHospitalofLinhaiCity,Linhai317000,China.E-mail:Cuirong1949@163.com)

AIM: To investigate the effects of ginsenoside Rg1 on the behavioral changes and the autophagy of hippocampal neurons of the rats with post-traumatic stress disorder (PTSD). METHODS: The Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups: control group, model group, fluoxetine group, low-dose ginsenoside Rg1 group and high-dose of ginsenoside Rg1 group. The combination of single prolonged stress and foot stock was performed to induce PTSD-like animal model. The rats in fluoxetine group was administered with fluoxetine by gavage at dose of 10 mg/kg for 21 d, while the rats in low and high doses of ginsenoside Rg1 groups were administered with ginsenoside Rg1 by gavage at doses of 20 mg/kg and 40 mg/kg for 21 d， respectively. The rats in control group and model group were both given saline by gavage for 21 d. The open-field test and stiff behavior test were used to examine the behavioral changes of the rats. The morphological structure and numerical changes of the hippocampal neurons were observed by Nissl-staining method. We adopted immunofluorescence labeling to observe the beclin 1 and LC3 positive hippocampal neurons and the levels of beclin 1 and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰratio in rat hippocampus. RESULTS: Compared with control group, decreased vertical movement time and horizontal movement time in open-field test and increased rate of stiff behavior in the stiff behavior test were observed in model group. Hippocampal neurons in model group were loosely arranged with vacuole-like structures and different degrees of cell shrinkage in contrast with control group. More beclin 1 and LC3 positive cells were identified, and higher protein levels of beclin 1 and ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ in model group were found as compared with control group. However, increase in movement in open-field test and decrease in stiff behavior were detected in the rats treated with low- and high-dose ginsenoside Rg1 as compared with the model rats. Meanwhile, vacuole structures, the numbers of beclin 1 and LC3 positive neurons, the protein expression of beclin 1 and LC3, and the total cell numbers were increased. Higher dose of ginsenoside Rg1 had more profound effects on these observed results. CONCLUSION: Ginsenoside Rg1 alleviates the abnormal behaviors in the PTSD rats, which might be related to the inhibition of abnormal autophagy of hippocampal neurons.

Post-traumatic stress disorder; Ginsenoside Rg1; Hippocampus; Autophagy

1000- 4718(2017)05- 0896- 06

2016- 12- 26

2017- 03- 02

浙江省公益性应用研究计划(实验动物)项目(No. 2014C37026； No. 2017C37124)

R925; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.021

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