酸中毒致大鼠离体冠状动脉收缩的机制*

2017-05-18贺泽芳侯晓敏范芳文郭鹏美张明升

中国病理生理杂志 2017年5期

关键词：外液槽内静息

贺泽芳，侯晓敏，杨蓉，范芳文，郭鹏美，刘宇，张明升

(山西医科大学药理学教研室，山西太原 030001)

酸中毒致大鼠离体冠状动脉收缩的机制*

贺泽芳，侯晓敏，杨蓉，范芳文，郭鹏美，刘宇，张明升△

(山西医科大学药理学教研室，山西太原 030001)

酸中毒是临床上比较常见的病理生理改变，糖尿病酮症、低氧血症、休克和肾疾患等多种病因均可诱发，可诱发一系列严重的心血管功能紊乱[1]。冠状动脉主要为心肌组织提供氧气和养分，当冠状动脉酸中毒时，整个心脏的功能将受到严重影响[2]。

氯离子是生物体中含量最丰富的阴离子。血管平滑肌细胞内的氯离子一般维持在高于平衡电位的水平，如此高浓度的细胞内氯离子在很多功能上起重要作用，如细胞内pH、细胞容积、细胞收缩性和膜电位，氯离子的很多细胞功能均依赖于氯离子通道的激活[7]。氯离子通道是氯离子跨膜转运的一个主要途径。在血管平滑肌细胞中，氯离子转运体和氯离子通道参与调节血管张力和维持动脉血压[8]。本研究初步探讨氯离子跨细胞膜运动在酸中毒引起RCA收缩中的作用。

本课题组前期实验已经表明，酸中毒引起的RCA收缩可能与钾通道、钙通道、质子泵、一氧化氮生成以及内钙释放等有关。本研究用NHE-1选择性抑制剂cariporide (HOE-642)和NBC抑制剂S0859进一步探讨细胞外酸中毒(pHex6.8)引起RCA收缩的机制，同时观察氯离子跨细胞膜运动是否参与了酸中毒引起的RCA收缩。

材料和方法

1 实验动物

正常雄性Sprague-Dawley大鼠，7周龄左右，230～270 g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，合格证号为SCXK(军)2012-0004。受试动物在本教研室动物房喂养1周后用于实验。

2 主要试剂和仪器

U46619、NPPB、NFA、HOE-642、S0859和NaBr均购自Sigma；其余为市售分析纯。正常PSS液的成分为(mmol/L)：NaCl 118, KCl 4.5, CaCl22.5, KH2PO40.8, MgCl2·6H2O 1.2, NaHCO320, glucose 10。pH 6.8的PSS液成分为(mmol/L)：20 mmol/L NaHCO3用6.0 mmol/L NaHCO3和14 mmol/L NaCl等量替换，其余同上。

PowerLab生物信号采集分析系统及张力换能器(ADInstruments)；Multi Myograph System-610M微血管张力记录仪(DMT)；Nikon解剖显微镜(Olympus)；PHS-3C精密pH计(上海雷磁公司)等。

3 主要方法

3.1 大鼠冠状动脉环的准备大鼠断头处死后立即取出心脏，置于正常PSS液(4 ℃， pH 7.4， 95% O2+ 5% CO2饱和)中。在解剖显微镜下用显微剪和镊剔除周围组织，依次分离出冠脉的室间隔支、室壁支和前降支，将其剪成约2 mm的血管环，通过2根钢丝(直径40 μm)固定于DMT记录仪。具体的血管环固定方法、标准化、活性测定以及实验条件稳定性检测参照文献[9]。

3.2 NHE-1和NBC抑制剂对酸中毒引起RCA收缩的影响血管环在盛有5 mL正常PSS液、38 ℃恒温、持续通入95% O2+ 5% CO2气体的浴槽中稳定60 min，期间每隔15 min换液1次。调节跨壁压使其相当于80 mmHg，以保证处于最适前负荷状态。再将浴槽内更换为同体积的KCl (60 mmol/L)刺激血管环收缩，当连续刺激3次的收缩幅度差异小于10%，认为血管环反应良好，开始正式实验。将浴槽内正常PSS液更换为pH 6.8的PSS液，待反应达平台后，用正常PSS液连续洗脱2次，使张力恢复到基础状态，稳定30 min后，向浴槽内加入终浓度为30 μmol/L HOE-642或100 μmol/L S0859，预孵30 min，更换为pH 6.8的PSS液，观察酸碱转运体抑制剂对pHex6.8引起RCA收缩的影响。以KCl (60 mmol/L)所致的最大收缩幅度为100%。

3.3 氯离子通道抑制剂对酸中毒引起RCA收缩的影响同上，在观察了pHex6.8引起冠状动脉环收缩后，在静息状态下，向浴槽内分别加入氯离子通道抑制剂5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸[5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoic acid， NPPB；浓度分别为10、30和100 μmol/L]或尼氟灭酸(niflunic acid， NFA; 浓度分别为10、30和100 μmol/L)预孵20 min，再更换为pH 6.8的PSS液。观察不同浓度NPPB或NFA对pHex6.8引起RCA收缩的影响。以pHex6.8所致的最大收缩幅度为100%。

3.4 氯离子通道抑制剂对KCl或U46619引起RCA收缩的影响在静息状态下，向浴槽内加入KCl (60 mmol/L)，待血管环收缩达坪台后，用pH 7.4的正常PSS液连续冲洗2次，恢复到静息状态稳定30 min后，向浴槽内分别加入不同浓度(10、30、100和300 μmol/L)的NPPB或NFA，预孵20 min，更换为KCl (60 mmol/L)溶液，观察NPPB和NFA对KCl引起RCA收缩的影响。同样，观察100 μmol/L NPPB或NFA对U46619 (1 μmol/L)引起RCA收缩的影响。以KCl (60 mmol/L)所致的最大收缩幅度为100%。

3.5 细胞外液去除氯离子对酸中毒引起RCA收缩的影响在静息状态下，将浴槽内pH 7.4的正常PSS液更换为pH 6.8的PSS液，待反应达坪台后，用pH 7.4的正常PSS液连续冲洗2次，恢复到静息状态稳定后，用NaBr等摩尔代替PSS液中的NaCl，稳定20 min，更换为pH 6.8的PSS液，观察细胞外液去除氯离子对pHex6.8引起RCA收缩的影响。以KCl (60 mmol/L)所致的最大收缩幅度为100%。

3.6 细胞外液去除氯离子对KCl或U46619引起RCA收缩的影响在静息状态下，向浴槽内加入KCl (60 mmol/L)或U46619 (1 μmol/L)，待血管环收缩达平台后，用pH 7.4的正常PSS液连续冲洗2次，恢复到静息状态稳定后，用溴化钠代替PSS液中的NaCl，稳定20 min，加入KCl (60 mmol/L)或U46619 (1 μmol/L)，观察细胞外液去除氯离子对KCl或血栓素A2 的类似物U46619引起RCA收缩的影响。以KCl (60 mmol/L)所致的最大收缩幅度为100%。

4 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用GraphPad Prism 6作图，SPSS 19.0进行配对t检验和两因素重复测量方差分析。通过非线性回归计算IC50值(抑制50% 最大收缩时所需要的药物浓度)。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1 NHE-1和NBC抑制剂对酸中毒引起RCA收缩的影响

将pH 7.4的正常PSS液更换为pH 6.8的PSS液后，引起的RCA最大收缩幅度为(3.90±0.95)mN，相当于KCl(60 mmol/L)最大收缩幅度的(105.07±10.65)%。30 μmol/L HOE-642可使pHex6.8引起的RCA收缩幅度降低(18.46±5.29)%(P<0.01)。100 μmol/L S0859使其收缩幅度降低(14.90±3.24)%(P<0.01)，见图1。

2 氯离子通道抑制剂对酸中毒引起RCA收缩的影响

预孵NPPB或NFA (10、30和100 μmol/L)后，均呈浓度依赖性地抑制酸中毒引起的RCA收缩(P<0.05)。不同浓度NPPB对pHex6.8引起RCA收缩的抑制百分比分别为(15.25±8.16)%、(44.40±8.92)%和(66.61±7.07)%，IC50值为43.62 μmol/L。不同浓度NFA对pHex6.8引起RCA收缩的抑制百分比分别为(24.31±9.51)%、(33.07±14.21)%和(64.48±11.68)%，IC50值为54.77,见图2。

Figure 1.The effects of NHE-1 inhibitor HOE-642 and NBC inhibitor S0859 on the RCA contraction induced by extracellular acidosis. Contractions were expressed as percentages of the maximal contraction induced by KCl (60 mmol/L). Mean±SD.n=6.**P<0.01vspHex6.8.

图1 NHE-1和NBC抑制剂对酸中毒引起RCA收缩的影响

Figure 2.The effects of inhibitors of chloride channel on the RCA contraction induced by extracellular acidosis. Contractions were expressed as percentages of contraction induced by pHex6.8. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vspHex6.8.

图2 氯离子通道抑制剂对酸中毒引起RCA收缩的影响

3 氯离子通道抑制剂对KCl或U46619引起RCA收缩的影响

预孵NPPB或NFA (10、30、100和300 μmol/L)后，均呈浓度依赖性地抑制KCl (60 mmol/L)引起的RCA收缩(P<0.05)，最大抑制百分比分别为(83.51±3.13)%和(52.37±12.31)%，IC50值分别为87.78 μmol/L和284.4 μmol/L，见图3。100 μmol/L的NPPB或NFA对U46619引起RCA收缩的抑制百分比分别为(44.04±9.68)%和(46.23±5.24)%，见图4。

Figure 3.The effects of inhibitors of chloride channel on the RCA contraction induced by KCl (60 mmol/L). Contractions were expressed as percentages of contraction induced by KCl (60 mmol/L). Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsKCl.

图3 氯离子通道抑制剂对KCl引起RCA收缩的影响

4 细胞外液去除氯离子对酸中毒引起RCA收缩的影响

用NaBr代替PSS液中的NaCl后，几乎完全抑制pHex6.8引起的RCA收缩(P<0.01)，而对KCl(60 mmol/L)或U46619 (1 μmol/L)引起的RCA收缩无显著影响,见图5。

Figure 4.The effects of inhibitors of chloride channel on the RCA contraction induced by U46619 (1 μmol/L). Contractions were expressed as percentages of contraction induced by KCl (60 mmol/L). Mean±SD.n=6.**P<0.01vsU46619.

图4 氯离子通道抑制剂对U46619引起RCA收缩的影响

Figure 5.The effects of extracellular chloride ion deprivation on the RCA contraction induced by extracellular acidosis, KCl or U46619. Contractions were expressed as percentages of contraction induced by KCl (60 mmol/L). Mean±SD.n=6.**P<0.01vspHex6.8.

图5 细胞外液去除氯离子对酸中毒、KCl和U46619引起RCA收缩的影响

讨论

本研究发现,细胞外酸中毒引起的RCA收缩与激活NHE-1和NBC有关；细胞外酸中毒引起的RCA收缩与氯离子跨细胞膜转运增强有关；细胞外氯离子在细胞外酸中毒引起的RCA收缩中起重要作用。

细胞外液酸化在大多数细胞同时引起一定程度的细胞内液酸化[10]，激活细胞膜上的酸碱转运体来调节细胞内的酸碱状态。NHE-1和NBCn1是生理状态下仅有的2个控制细胞酸碱度的转运体[4-5]，不仅参与细胞内pH值调节，而且影响动脉张力的调节。NBCn1和NHE1基因敲除的小鼠可出现心血管系统的紊乱，如血压降低[5, 11]。本次研究用不同的酸化方法再次证实细胞外液酸化能够引起RCA收缩，而且与激活NHE-1和NBC有关。

综上所述，酸中毒能引起RCA收缩，其收缩机制可能与NHE-1、NBC和氯离子通道活性增强有关。

[1] Adrogue HJ, Madias NE. Management of life-threatening acid-base disorders. First of two parts[J]. N Engl J Med, 1998, 338 (1):26-34.

[2] 李江涛, 刘宇, 牛龙刚, 等. 细胞外酸性环境对大鼠冠状动脉环静息张力的影响及其钾通道阻断剂的关系[J]. 中西医结合心脑血管病杂志, 2014, 12(9): 1112-1113.

[3] Thomsen AB, Kim S, Aalbaek F, et al. Intracellular acidification alters myogenic responsiveness and vasomotion of mouse middle cerebral arteries[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2014, 34(1):161-168.

[4] Boedtkjer E, Praetorius J, Aalkjaer C. NBCn1(slc4a7) mediates the Na+-dependent bicarbonate transport important of intracellular pH in mouse vascular smooth muscle cells[J]. Circ Res, 2006, 98(4):515-523.

[5] Boedtkjer E, Damkier HH, Aalkjaer C. NHE1 knockout reduces blood pressure and arterial media/lumen ratio with no effect on resting pH(i) in the vascular wall[J]. J Physiol, 2012, 590(8):1895-1906.

[6] Aalkjaer C, Hughes A. Chloride and bicarbonate transport in rat resistance arteries[J]. J Physiol, 1991, 436:57-73.

[7] Cruickshank SF, Baxter LM, Drummond RM. The Cl(-) channel blocker niflumic acid releases Ca2+from an intracellular store in rat pulmonary artery smooth muscle cells [J]. Br J Pharmacol, 2003, 140(8):1442-1450.

[8] Matchkov VV, Secher Dam V, Bodtkjer DM, et al. Transport and function of chloride in vascular smooth muscles[J]. J Vasc Res, 2013, 50(1):69-87.

[9] Niu L, Liu Y, Hou X, et al. Extracelluar acidosis contracts coronary but neither renal nor mesenteric artery via modulation of H+,K+-ATPase, voltage-gated K+channels and L-type Ca2+channels[J]. Exp Physiol, 2014, 99(7):995-1006.

[10]Nakanishi T, Gu H, Momma K. Developmental changes in the effect of acidosis on contraction, intracellular pH, and calcium in the rabbit mesenteric small artery[J]. Pediatr Res, 1997, 42(6):750-757.

[11]Boedtkjer E, Bentzon JF, Dam VS, et al. Na+, HCO3--cotransporter NBCn1 increases pHi gradients, filopodia, and migration of smooth muscle cells and promotes arterial remodelling[J]. Cardiovasc Res, 2016, 111(3):227-239.

[12]Kang XL, Zhang M, Liu J, et al. Differences between femoral artery and vein smooth muscle cells in volume-regulated chloride channels[J]. Can J Physiol Pharmacol, 2012, 90(11):1516-1526.

[13]Bulley S, Neeb ZP, Burris SK, et al. TMEM16A/ANO1 channels contribute to the myogenic response in cerebral arteries[J]. Circ Res, 2012, 111 (8):1027-1036.

[14]陈传斯, 庞玉生. 钙激活性氯离子通道与高肺血流性肺动脉高压 [J]. 中国病理生理杂志, 2012, 28(12):2297-2300.

[15]黎关龙, 黄林静, 何金波, 等. 容量激活性氯离子通道在低氧高二氧化碳处理的大鼠PASMCs的表达及其与MAPK通路的关系[J]. 中国病理生理杂志, 2014, 30 (1): 25-29.

[16]Mongin AA. Volume-regulated anion channel: a frenemy within the brain[J]. Pflugers Arch, 2016, 468(3):421-441.

(责任编辑：卢萍，罗森)

Mechanisms underlying contraction of rat isolated coronary artery induced by acidosis

HE Ze-fang, HOU Xiao-min, YANG Rong, FAN Fang-wen, GUO Peng-mei, LIU Yu, ZHANG Ming-sheng

(DepartmentofPharmacology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail: 4156589@sina.com)

1000- 4718(2017)05- 0838- 05

2016- 12- 05

2017- 02- 16

国家自然科学基金资助项目(No.81603111); 山西省生物优势学科基金; 山西医科大学博士启动基金(No. 03201510)

R363