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基于水煎液中挥发性成分含量变化规律探索银翘散“香气大出即取服”的科学内涵

2017-05-17罗云杨明李舒宇游雅丽张婧廖正根

中国中药杂志 2016年18期
关键词:挥发性成分水煎液银翘散

罗云+杨明+李舒宇+游雅丽+张婧+廖正根

[摘要]建立银翘散水煎液中3种挥发性成分薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的含量测定方法,探索银翘散水煎液煎煮过程挥发性成分的变化规律,为阐明银翘散“香气大出即取服”的科学内涵提供研究基础。制备不同煎煮时间银翘散水煎液,采用GC-MS定性分析其中挥发性成分的组成并测定薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的含量,考察不同煎煮时间对银翘散水煎液中挥发性成分含量的影响。结果显示,银翘散水煎液中的挥发性成分主要来源于薄荷、荆芥、连翘3味药材;随着煎煮时间的延长,银翘散水煎液中3种挥发性成分的浓度均先增大后逐渐减小;浸泡30min后,刚煮沸时,煮沸5,10,15,20,30,40,50,60 min时,银翘散水煎液中薄荷酮的质量浓度分别为0.058,0.268,0.216,0.073,0.065,0.048,0.048,0.041,0.038,0.034 mg·L-1,薄荷脑的质量浓度分别为0.965,2.847,3.633,2.420,1.539,1.189,1.273,1.188,0.905,0.663 mg·L-1。,胡薄荷酮的质量浓度分别为0.355,0.522,0.598,0.477,0.374,0.374,0.339,0.355,0.248,0.251 mg·L-1,3种成分总浓度分别为1.377,3.637,4.446,2.970,1.979,1.611,1.660,1.583,1.191,0.947 mg·L-1。结果表明,煎煮时间对银翘散水煎液中挥发性成分含量影响较大,煮沸约5min时,香气大出,水煎液中3种挥发性成分的浓度较大,煮沸15min后,香气变淡,水煎液中3种挥发性成分浓度明显变小,提示银翘散“香气大出即取服”传统煎煮方法具有一定的科学依据。

[关键词]银翘散;水煎液;挥发性成分;香气大出;科学内涵;含量测定

中药煎煮方法和提取工艺的合理性对保证中药的临床疗效至关重要,提取终点的判断一直是困扰研究者的技术难题,尤其对于含挥发性组分的解表类中药。银翘散为辛凉解表的中医经典名方,由金银花、连翘、薄荷、荆芥、牛蒡子、桔梗、淡竹叶、淡豆豉、甘草、芦根等组成,具有疏风解表、清热解毒功效,用于风热感冒、发热头痛、咳嗽口干、咽喉疼痛。原方作者吴鞠通认为“香气”是银翘散的主要有效成分之一,长时间的煎煮可能会使“香气”大量挥发,导致临床疗效降低,故特别强调其煎煮方法为“香气大出,即取服,勿过煮,肺药取轻清,过煮则味厚而人中焦矣”。然而,银翘散类方现代中药制剂大多需要长时间煎煮提取,这与其传统煎煮用药经验相悖而受到较多质疑。那么,银翘散原方所强调的“香气大出即取服”科学内涵何在?如何将其传统煎煮方法转化用于类方制剂的提取工艺?这些均是当前亟待解决的关键问题。

银翘散为煮散剂,临床服用其水煎液,水煎液中香气和非香气成分的浓度变化对临床疗效均有较大的影响。因此,研究银翘散水煎液在煎煮过程中化学成分的变化规律,可为阐明银翘散“香气大出即取服”的科学内涵和合理制定银翘散煎煮工艺提供科学依据。根据菲克扩散理论,挥发性组分蒸发速度与浓度成正比,药液中挥发性组分浓度越大,挥发性组分蒸发速度越大,故推测“香气大出”之时,药液中“香气”的浓度也最大,但目前尚未有相关实验研究证实这一假说。

“香气”主要是指挥发性成分,银翘散中含有“香气”的药材主要有薄荷、荆芥、连翘、金银花等,薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮是薄荷、荆芥等挥发油中的主要成分。本研究在前期研究了银翘散煎煮过程水煎液化学特征图谱和5种非挥发性成分含量变化规律以及3种挥发性成分蒸发规律的基础上,建立GC-MS测定银翘散水煎液中挥发性成分薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的含量测定方法,研究不同煎煮时间银翘散水煎液中挥发性成分的变化规律,为阐明银翘散“香气大出即取服”的科学内涵提供研究基础。

1材料

Agilent 7890A气相色谱仪-5975C质谱联用仪(美国Agilent公司);BT25S电子分析天平(1/10万),BSAl24S电子分析天平(1/1万)(德国Sartofi-us公司);MH-2000型可调式电热套(北京科伟永兴仪器有限公司);JK-5200型超声波清洗器(功率200w,频率40kHz,合肥金尼克机械制造有限公司)。

薄荷酮对照品(批号111705-201105,纯度为99.8%)、薄荷脑对照品(批号110728-00506,纯度为100.0%)、胡薄荷酮对照品(批号111706.201205,纯度为99.8%)购自中国食品药品检定研究院;银翘散(自制,批号151125),高纯氦气(江西省南昌市宏伟气体有限公司);水为双蒸馏水;其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1GC-MS分析条件

2.1.1色谱条件HP-5MS石英毛细管柱(0.25μmx0.25mmx30m);载气为高纯度氦气;体积流量1.0mL·min-1;进样量1.0μL;模式为不分流;进样口温度250℃;接口温度280℃;程序升温:50℃保持2min,以2℃·min-1。升至80℃,再以3℃·min-1升至180℃。

2.1.2质谱条件EI电离源;电子能量70 eV;离子源温度230℃;四级杆温度150℃;扫描范围m/z35~500。

2.2对照品溶液的制备

2.2.1薄荷酮对照品溶液的制备精密称取薄荷酮对照品7.35mg,置10mL量瓶中,加入乙醚使溶解,并定容至刻度,摇匀,即得每1 mL含薄荷脑0.735mg对照品溶液。

2.2.2薄荷脑对照品溶液的制备精密称取薄荷脑对照品4.76mg,置10mL量瓶中,加入乙醚使溶解,并定容至刻度,搖匀,即得每1mL含薄荷脑0.476mg对照品溶液。

2.2.3胡薄荷酮对照品溶液的制备精密称取胡薄荷酮对照品15.37mg,置10mL量瓶中,加入乙醚使溶解,并定容至刻度,摇匀,即得每1mL含薄荷脑1.537mg对照品溶液。

2.2.4混合对照品溶液的制备取薄荷酮对照品溶液0.4mL,薄荷脑对照品溶液3.2mL,胡薄荷酮对照品溶液0.4mL,混匀,即得混合对照品溶液,再用乙醚等比稀释制成不同浓度的混合对照品溶液,备用。

2.3不同煎煮时间银翘散水煎液样品的制备

按照《中国药典》2015年版一部银翘散的处方和制法,称取金银花100g、连翘100g、桔梗60g、薄荷60g、淡豆豉50g、淡竹叶40g、牛蒡子60g、荆芥40g、芦根100g、甘草40g,粉碎成细粉,过筛,混匀,制成银翘散。称取银翘散110.0g,置2000mL烧瓶中,加入1100mL(10倍量)水,浸泡30min后取样10mL(S1),加热提取,约20min后开始沸腾,立即取样10mL(S2),继续加热,于煮沸后5min(S3),10min(S4),15min(S5),20min(S6),30min(S7),40min(S8),50min(S9),60min(S10)分别取样10mL,放冷,加乙醚5mL振摇萃取,即得。

2.4银翘散水煎液中挥发性成分的定性分析

银翘散水煎液中挥发性成分的GC-MS总离子流色谱图见图1。经计算机贮存信号的检索及质谱图进行解析确定化合物,对GC-MS总离子流色谱图进行了初步指认,去除可能为乙醚溶剂中的抗氧剂2,6.二叔丁基对甲苯酚(BHT,tR=37.14min),采用峰面积归一化法测定各成分相对质量分数,共确定色谱峰19个,其中相对质量分数大于1.5%的色谱峰13个,占93.29%。结合单味药材挥发油的色谱图和质谱图,初步确定了银翘散水煎液中挥发性成分的来源,见表1。其中,薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮3个指标成分相对质量分数较大,分别为1.89%,20.53%,3.27%,可以较好地反映银翘散水煎液挥发性成分的变化规律,故选择其作为指标成分。

2.5分析方法验证

2.5.1系统适用性试验按2.1项下分析条件进行检测,以薄荷脑计算理论塔板数大于3000,分离度大于1.5。混合对照品溶液、银翘散供试品溶液的色谱图见图1。结果表明,在上述色谱条件下,各所测成分分离度良好。

2.5.2线性关系考察取不同浓度的混合对照品溶液,按上述色谱条件进样1μL,记录色谱峰面积,以进样量x(μg)为横坐标,峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线,并拟合回归方程,分别为薄荷酮:Y=2953548317X-173781,r=0.999 5;薄荷脑:Y=3064262418X-989 782,r=0.9991;胡薄荷酮:Y,=2839280 785X7-67 237,r=0.9997。结果表明,薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮分别在0.0718~2.30,0.186~11.9,0.150~19.2ng线性关系良好。2.5.3精密度试验精密吸取混合对照品溶液1μL,重复进样6次,测定峰面积积分值,结果薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮峰面积的RSD分别为1.6%,0.93%,0.59%,表明仪器的精密度良好。

2.5.4稳定性试验精密吸取同一供试品溶液1μL,进样测定峰面积,每4h测定1次,结果薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮峰面积的RSD分别为1.6%,1.1%,1.2%(n=7),表明样品溶液在24h内稳定。

2.5.5重复性试验取同一银翘散水煎液6份,按2.3项下的方法制备供试品溶液,精密吸取1μL,注入气相色谱仪,测得薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的平均浓度为0.216,3.633,0.598mg·L-1,RSD分别为0.64%,0.95%,1.3%,表明方法的重复性良好。

2.5.6加样回收试验取同一已知含量的银翘散水煎液6份,按照100%样品含量精密加入薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮对照品溶液,混匀,按2.3项下的方法制备供试品溶液,进样1μL,测定峰面积,计算回收率,薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的平均回收率为96.9%,98.4%,97.7%,RSD分别为1.6%,1.8%,2.3%,结果表明加样回收率良好,方法可行。

2.5.7不同煎煮时间银翘散水煎液中薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的含量测定取不同煎煮时间所得银翘散水煎液样品,按2.3项下方法制备供试品溶液,在2.1项下色谱条件进行测定,每份进样2次,以外标一点法计算样品中薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的平均含量,结果见表2。

由表2可见,随着煎煮时间的延长,水煎液中3种挥发性成分的浓度均先增大后逐渐减小。浸泡30min后,银翘散3种挥发性成分均有不同程度的溶出,薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮分别达到最大浓度的21.6%,26.6%,59.3%,此时香气较淡,挥发性成分并没有大量挥发;刚煮沸时,薄荷酮的浓度达到最大值,薄荷脑、胡薄荷酮分别达到最大浓度的78.4%,87.3%,香气渐浓,挥发性成分开始挥发;煮沸5min时,水煎液中薄荷酮的浓度下降至最大浓度的80.4%,而薄荷脑、胡薄荷酮浓度以及3种成分总浓度均达到最大;此时通过嗅觉判断香气也最浓,提示挥发性成分蒸发速度达到最大;煮沸10min时,薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的浓度分别下降至最大浓度的27.1%,66.6%,79.7%;煮沸15min时,香气变淡,薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的浓度分别下降至最大浓度的24.3%,42.4%,62.6%,3种成分总浓度降至最大浓度的44.5%,提示挥发性成分已大量蒸发散失;至煮沸60min时,薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的浓度分别下降至最大浓度的12.6%,18.2%,41.9%,3种成分总浓度降至最大浓度的21.3%,提示挥发性成分已蒸发殆尽。

结果表明,随着煎煮时间的延长,薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮溶出越来越多,到煮沸5min时,香气大出,薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮大量溶出并挥发,水煎液中浓度达到最大;随着煎煮时间的再延长,薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮大量挥发散失,至煮沸15min时,香气变淡,银翘散水煎液中3种挥发性成分总浓度降至最大浓度的45%以下。可见,煎煮时间对银翘散水煎液中挥发性成分含量影响较大,煮沸5min时,香气大出,水煎液中挥发性成分的浓度最大,银翘散“香气大出即取服”传统煎煮方法具有一定的科学依据。

3讨论

金银花、连翘、薄荷、荆芥等含挥发性成分的药材,煎煮时有效成分易挥发,入药宜后下,不宜久煎。银翘散为煮散剂,用的是经过粉碎后的药材饮片,与原药材饮片相比,粒度更小,扩散面积增大,溶出速度加快,溶出物质增加,缩短了煎煮时间,能较好地保留挥发性成分,有利于提高药材的利用率和疗效。本研究结果显示,在同时入药的情况下,银翘散不经煎煮,浸泡30min后,挥发性成分薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮均有一定程度的溶出,此时香气较淡,挥发性成分并没有大量挥发;随着煎煮时间的延长,3种挥发性成分溶出越来越多,到煮沸5min时,香气大出,3种挥发性成分大量溶出并挥发,水煎液中浓度也达到最大;随着煎煮时间的再延长,3种挥发性成分大量挥发散失,至煮沸15min时,银翘散水煎液中3种挥发性成分的浓度已降至最大浓度的44.5%,香气变淡,提示挥发性成分已大量蒸发散失。结果表明,银翘散作为煮散剂,在保证挥发性成分大量溶出的情况下,缩短了煎煮时间,较好地保留了挥发性有效成分,有利于提高药材的利用率和临床疗效。

“香气大出”是指煎煮药味最浓郁时,是提取终点的嗅觉判断标准,有人认为以煮沸20min为宜,也有人认为煮沸10~15min为好,还有人认为煮沸3~5min最佳。刘亚娴等以银翘散为主方治疗小儿外感高热125例,以急性上呼吸道感染最多(95例),煎煮时间为煮沸后3min即可,一般1~2d即可退热,并进行了免疫调节和解热等相关药理实验,结果表明,煮沸3~6min,银翘散的作用最强。笔者前期研究发现,银翘散煮沸约5min时,香气大出,水煎液中5种非挥发性成分绿原酸、连翘苷、牛蒡苷、甘草苷、甘草酸的浓度均较大,3种挥发性成分薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的蒸发速度也达到最大。本研究结果表明,银翘散煮沸约5min时,水煎液中3种挥发性成分的浓度也较大,验证了“香气大出”之时,水煎液中“香气”的浓度也最大的推测。研究结果还表明,银翘散煮沸约5min时,香气大出,水煎液中挥发性成分的浓度较大,蒸发速度也较大,同时非挥发性成分浓度也较大,提示银翘散“香气大出即取服”传统煎煮方法具有一定的科学依据。

关于银翘散的煎煮方法,还有很多文献从不同角度进行了研究,主要集中在药效和化学成分2個方面。束雅春等以绿原酸、芦丁、橙皮苷、连翘苷、牛蒡苷5种成分及浸出物含量为指标,通过单因素考察确定了适宜工艺水平后,采用正交试验优选银翘散传统煎煮最佳工艺,为规范临床中药汤剂煎煮方法提供实验依据;同时,通过比较银翘散在不同煎煮方式下对实验动物抗炎解热作用的影响,探讨最佳煎煮方式,结果表明,传统砂锅煎煮药效优于常压煎药机和高压煎药机煎煮,这与5种药效成分与浸出物含量测定结果一致,为准确合理地使用银翘散汤剂最佳煎煮方式、发挥最佳临床疗效提供了实验依据。采用传统砂锅煎药,具有化学性质稳定、传热快、导热均匀、散热慢、火候大小可随意调节、水分蒸发量小等特点。由于实验室条件的限制,本研究采用可调温电热套加热玻璃烧瓶替代传统砂锅煎药方式,玻璃烧瓶化学性质稳定、传热快,可调温电热套导热均匀、散热慢,且火候大小可随意调节,先大功率煮沸,再调小加热功率,保持微沸,水分蒸发量小,两者联合使用可较好地模拟传统的砂锅煎煮。

此外,银翘散挥发性成分的组成和香味的构成均极为复杂,低含量成分可能对香气的贡献值较大,由于实验条件的局限,本研究仅以其中的3种指标性成分薄荷酮、薄荷脑和胡薄荷酮含量变化来表征香气浓淡变化尚有不足之处,有待进一步完善,笔者将采用电子鼻等技术手段量化香气,为进一步阐明银翘散“香气大出即取服”的科学内涵提供科学依据。

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