基于水煎液中挥发性成分含量变化规律探索银翘散“香气大出即取服”的科学内涵

罗云+杨明+李舒宇+游雅丽+张婧+廖正根

[摘要]建立银翘散水煎液中3种挥发性成分薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的含量测定方法，探索银翘散水煎液煎煮过程挥发性成分的变化规律，为阐明银翘散“香气大出即取服”的科学内涵提供研究基础。制备不同煎煮时间银翘散水煎液，采用GC-MS定性分析其中挥发性成分的组成并测定薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的含量，考察不同煎煮时间对银翘散水煎液中挥发性成分含量的影响。结果显示，银翘散水煎液中的挥发性成分主要来源于薄荷、荆芥、连翘3味药材；随着煎煮时间的延长，银翘散水煎液中3种挥发性成分的浓度均先增大后逐渐减小；浸泡30min后，刚煮沸时，煮沸5，10，15，20，30，40，50，60 min时，银翘散水煎液中薄荷酮的质量浓度分别为0.058，0.268，0.216，0.073，0.065，0.048，0.048，0.041，0.038，0.034 mg·L^-1，薄荷脑的质量浓度分别为0.965，2.847，3.633，2.420，1.539，1.189，1.273，1.188，0.905，0.663 mg·L^-1。，胡薄荷酮的质量浓度分别为0.355，0.522，0.598，0.477，0.374，0.374，0.339，0.355，0.248，0.251 mg·L^-1，3种成分总浓度分别为1.377，3.637，4.446，2.970，1.979，1.611，1.660，1.583，1.191，0.947 mg·L^-1。结果表明，煎煮时间对银翘散水煎液中挥发性成分含量影响较大，煮沸约5min时，香气大出，水煎液中3种挥发性成分的浓度较大，煮沸15min后，香气变淡，水煎液中3种挥发性成分浓度明显变小，提示银翘散“香气大出即取服”传统煎煮方法具有一定的科学依据。

[关键词]银翘散；水煎液；挥发性成分；香气大出；科学内涵；含量测定

中药煎煮方法和提取工艺的合理性对保证中药的临床疗效至关重要，提取终点的判断一直是困扰研究者的技术难题，尤其对于含挥发性组分的解表类中药。银翘散为辛凉解表的中医经典名方，由金银花、连翘、薄荷、荆芥、牛蒡子、桔梗、淡竹叶、淡豆豉、甘草、芦根等组成，具有疏风解表、清热解毒功效，用于风热感冒、发热头痛、咳嗽口干、咽喉疼痛。原方作者吴鞠通认为“香气”是银翘散的主要有效成分之一，长时间的煎煮可能会使“香气”大量挥发，导致临床疗效降低，故特别强调其煎煮方法为“香气大出，即取服，勿过煮，肺药取轻清，过煮则味厚而人中焦矣”。然而，银翘散类方现代中药制剂大多需要长时间煎煮提取，这与其传统煎煮用药经验相悖而受到较多质疑。那么，银翘散原方所强调的“香气大出即取服”科学内涵何在？如何将其传统煎煮方法转化用于类方制剂的提取工艺？这些均是当前亟待解决的关键问题。

银翘散为煮散剂，临床服用其水煎液，水煎液中香气和非香气成分的浓度变化对临床疗效均有较大的影响。因此，研究银翘散水煎液在煎煮过程中化学成分的变化规律，可为阐明银翘散“香气大出即取服”的科学内涵和合理制定银翘散煎煮工艺提供科学依据。根据菲克扩散理论，挥发性组分蒸发速度与浓度成正比，药液中挥发性组分浓度越大，挥发性组分蒸发速度越大，故推测“香气大出”之时，药液中“香气”的浓度也最大，但目前尚未有相关实验研究证实这一假说。

“香气”主要是指挥发性成分，银翘散中含有“香气”的药材主要有薄荷、荆芥、连翘、金银花等，薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮是薄荷、荆芥等挥发油中的主要成分。本研究在前期研究了银翘散煎煮过程水煎液化学特征图谱和5种非挥发性成分含量变化规律以及3种挥发性成分蒸发规律的基础上，建立GC-MS测定银翘散水煎液中挥发性成分薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的含量测定方法，研究不同煎煮时间银翘散水煎液中挥发性成分的变化规律，为阐明银翘散“香气大出即取服”的科学内涵提供研究基础。

1材料

Agilent 7890A气相色谱仪-5975C质谱联用仪（美国Agilent公司）；BT25S电子分析天平（1/10万），BSAl24S电子分析天平（1/1万）（德国Sartofi-us公司）；MH-2000型可调式电热套（北京科伟永兴仪器有限公司）；JK-5200型超声波清洗器（功率200w，频率40kHz，合肥金尼克机械制造有限公司）。

薄荷酮对照品（批号111705-201105，纯度为99.8%）、薄荷脑对照品（批号110728-00506，纯度为100.0%）、胡薄荷酮对照品（批号111706.201205，纯度为99.8%）购自中国食品药品检定研究院；银翘散（自制，批号151125），高纯氦气（江西省南昌市宏伟气体有限公司）；水为双蒸馏水；其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1GC-MS分析条件

2.1.1色谱条件HP-5MS石英毛细管柱（0.25μmx0.25mmx30m）；载气为高纯度氦气；体积流量1.0mL·min^-1；进样量1.0μL；模式为不分流；进样口温度250℃；接口温度280℃；程序升温：50℃保持2min，以2℃·min^-1。升至80℃，再以3℃·min^-1升至180℃。

2.1.2质谱条件EI电离源；电子能量70 eV；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；扫描范围m/z35～500。

2.2对照品溶液的制备

2.2.1薄荷酮对照品溶液的制备精密称取薄荷酮对照品7.35mg，置10mL量瓶中，加入乙醚使溶解，并定容至刻度，摇匀，即得每1 mL含薄荷脑0.735mg对照品溶液。

2.2.2薄荷脑对照品溶液的制备精密称取薄荷脑对照品4.76mg，置10mL量瓶中，加入乙醚使溶解，并定容至刻度，搖匀，即得每1mL含薄荷脑0.476mg对照品溶液。

2.2.3胡薄荷酮对照品溶液的制备精密称取胡薄荷酮对照品15.37mg，置10mL量瓶中，加入乙醚使溶解，并定容至刻度，摇匀，即得每1mL含薄荷脑1.537mg对照品溶液。

2.2.4混合对照品溶液的制备取薄荷酮对照品溶液0.4mL，薄荷脑对照品溶液3.2mL，胡薄荷酮对照品溶液0.4mL，混匀，即得混合对照品溶液，再用乙醚等比稀释制成不同浓度的混合对照品溶液，备用。

2.3不同煎煮时间银翘散水煎液样品的制备

按照《中国药典》2015年版一部银翘散的处方和制法，称取金银花100g、连翘100g、桔梗60g、薄荷60g、淡豆豉50g、淡竹叶40g、牛蒡子60g、荆芥40g、芦根100g、甘草40g，粉碎成细粉，过筛，混匀，制成银翘散。称取银翘散110.0g，置2000mL烧瓶中，加入1100mL（10倍量）水，浸泡30min后取样10mL（S1），加热提取，约20min后开始沸腾，立即取样10mL（S2），继续加热，于煮沸后5min（S3），10min（S4），15min（S5），20min（S6），30min（S7），40min（S8），50min（S9），60min（S10）分别取样10mL，放冷，加乙醚5mL振摇萃取，即得。

2.4银翘散水煎液中挥发性成分的定性分析

银翘散水煎液中挥发性成分的GC-MS总离子流色谱图见图1。经计算机贮存信号的检索及质谱图进行解析确定化合物，对GC-MS总离子流色谱图进行了初步指认，去除可能为乙醚溶剂中的抗氧剂2，6.二叔丁基对甲苯酚（BHT，tR=37.14min），采用峰面积归一化法测定各成分相对质量分数，共确定色谱峰19个，其中相对质量分数大于1.5%的色谱峰13个，占93.29%。结合单味药材挥发油的色谱图和质谱图，初步确定了银翘散水煎液中挥发性成分的来源，见表1。其中，薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮3个指标成分相对质量分数较大，分别为1.89%，20.53%，3.27%，可以较好地反映银翘散水煎液挥发性成分的变化规律，故选择其作为指标成分。

2.5分析方法验证

2.5.1系统适用性试验按2.1项下分析条件进行检测，以薄荷脑计算理论塔板数大于3000，分离度大于1.5。混合对照品溶液、银翘散供试品溶液的色谱图见图1。结果表明，在上述色谱条件下，各所测成分分离度良好。

2.5.2线性关系考察取不同浓度的混合对照品溶液，按上述色谱条件进样1μL，记录色谱峰面积，以进样量x（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，并拟合回归方程，分别为薄荷酮：Y=2953548317X-173781，r=0.999 5；薄荷脑：Y=3064262418X-989 782，r=0.9991；胡薄荷酮：Y，=2839280 785X7-67 237，r=0.9997。结果表明，薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮分别在0.0718～2.30，0.186～11.9，0.150～19.2ng线性关系良好。2.5.3精密度试验精密吸取混合对照品溶液1μL，重复进样6次，测定峰面积积分值，结果薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮峰面积的RSD分别为1.6%，0.93%，0.59%，表明仪器的精密度良好。

2.5.4稳定性试验精密吸取同一供试品溶液1μL，进样测定峰面积，每4h测定1次，结果薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮峰面积的RSD分别为1.6%，1.1%，1.2%（n=7），表明样品溶液在24h内稳定。

2.5.5重复性试验取同一银翘散水煎液6份，按2.3项下的方法制备供试品溶液，精密吸取1μL，注入气相色谱仪，测得薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的平均浓度为0.216，3.633，0.598mg·L^-1，RSD分别为0.64%，0.95%，1.3%，表明方法的重复性良好。

2.5.6加样回收试验取同一已知含量的银翘散水煎液6份，按照100%样品含量精密加入薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮对照品溶液，混匀，按2.3项下的方法制备供试品溶液，进样1μL，测定峰面积，计算回收率，薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的平均回收率为96.9%，98.4%，97.7%，RSD分别为1.6%，1.8%，2.3%，结果表明加样回收率良好，方法可行。

2.5.7不同煎煮时间银翘散水煎液中薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的含量测定取不同煎煮时间所得银翘散水煎液样品，按2.3项下方法制备供试品溶液，在2.1项下色谱条件进行测定，每份进样2次，以外标一点法计算样品中薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的平均含量，结果见表2。

由表2可见，随着煎煮时间的延长，水煎液中3种挥发性成分的浓度均先增大后逐渐减小。浸泡30min后，银翘散3种挥发性成分均有不同程度的溶出，薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮分别达到最大浓度的21.6%，26.6%，59.3%，此时香气较淡，挥发性成分并没有大量挥发；刚煮沸时，薄荷酮的浓度达到最大值，薄荷脑、胡薄荷酮分别达到最大浓度的78.4%，87.3%，香气渐浓，挥发性成分开始挥发；煮沸5min时，水煎液中薄荷酮的浓度下降至最大浓度的80.4%，而薄荷脑、胡薄荷酮浓度以及3种成分总浓度均达到最大；此时通过嗅觉判断香气也最浓，提示挥发性成分蒸发速度达到最大；煮沸10min时，薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的浓度分别下降至最大浓度的27.1%，66.6%，79.7%；煮沸15min时，香气变淡，薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的浓度分别下降至最大浓度的24.3%，42.4%，62.6%，3种成分总浓度降至最大浓度的44.5%，提示挥发性成分已大量蒸发散失；至煮沸60min时，薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的浓度分别下降至最大浓度的12.6%，18.2%，41.9%，3种成分总浓度降至最大浓度的21.3%，提示挥发性成分已蒸发殆尽。

结果表明，随着煎煮时间的延长，薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮溶出越来越多，到煮沸5min时，香气大出，薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮大量溶出并挥发，水煎液中浓度达到最大；随着煎煮时间的再延长，薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮大量挥发散失，至煮沸15min时，香气变淡，银翘散水煎液中3种挥发性成分总浓度降至最大浓度的45%以下。可见，煎煮时间对银翘散水煎液中挥发性成分含量影响较大，煮沸5min时，香气大出，水煎液中挥发性成分的浓度最大，银翘散“香气大出即取服”传统煎煮方法具有一定的科学依据。

3讨论

金银花、连翘、薄荷、荆芥等含挥发性成分的药材，煎煮时有效成分易挥发，入药宜后下，不宜久煎。银翘散为煮散剂，用的是经过粉碎后的药材饮片，与原药材饮片相比，粒度更小，扩散面积增大，溶出速度加快，溶出物质增加，缩短了煎煮时间，能较好地保留挥发性成分，有利于提高药材的利用率和疗效。本研究结果显示，在同时入药的情况下，银翘散不经煎煮，浸泡30min后，挥发性成分薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮均有一定程度的溶出，此时香气较淡，挥发性成分并没有大量挥发；随着煎煮时间的延长，3种挥发性成分溶出越来越多，到煮沸5min时，香气大出，3种挥发性成分大量溶出并挥发，水煎液中浓度也达到最大；随着煎煮时间的再延长，3种挥发性成分大量挥发散失，至煮沸15min时，银翘散水煎液中3种挥发性成分的浓度已降至最大浓度的44.5%，香气变淡，提示挥发性成分已大量蒸发散失。结果表明，银翘散作为煮散剂，在保证挥发性成分大量溶出的情况下，缩短了煎煮时间，较好地保留了挥发性有效成分，有利于提高药材的利用率和临床疗效。

“香气大出”是指煎煮药味最浓郁时，是提取终点的嗅觉判断标准，有人认为以煮沸20min为宜，也有人认为煮沸10～15min为好，还有人认为煮沸3～5min最佳。刘亚娴等以银翘散为主方治疗小儿外感高热125例，以急性上呼吸道感染最多（95例），煎煮时间为煮沸后3min即可，一般1～2d即可退热，并进行了免疫调节和解热等相关药理实验，结果表明，煮沸3～6min，银翘散的作用最强。笔者前期研究发现，银翘散煮沸约5min时，香气大出，水煎液中5种非挥发性成分绿原酸、连翘苷、牛蒡苷、甘草苷、甘草酸的浓度均较大，3种挥发性成分薄荷酮、薄荷脑、胡薄荷酮的蒸发速度也达到最大。本研究结果表明，银翘散煮沸约5min时，水煎液中3种挥发性成分的浓度也较大，验证了“香气大出”之时，水煎液中“香气”的浓度也最大的推测。研究结果还表明，银翘散煮沸约5min时，香气大出，水煎液中挥发性成分的浓度较大，蒸发速度也较大，同时非挥发性成分浓度也较大，提示银翘散“香气大出即取服”传统煎煮方法具有一定的科学依据。

关于银翘散的煎煮方法，还有很多文献从不同角度进行了研究，主要集中在药效和化学成分2個方面。束雅春等以绿原酸、芦丁、橙皮苷、连翘苷、牛蒡苷5种成分及浸出物含量为指标，通过单因素考察确定了适宜工艺水平后，采用正交试验优选银翘散传统煎煮最佳工艺，为规范临床中药汤剂煎煮方法提供实验依据；同时，通过比较银翘散在不同煎煮方式下对实验动物抗炎解热作用的影响，探讨最佳煎煮方式，结果表明，传统砂锅煎煮药效优于常压煎药机和高压煎药机煎煮，这与5种药效成分与浸出物含量测定结果一致，为准确合理地使用银翘散汤剂最佳煎煮方式、发挥最佳临床疗效提供了实验依据。采用传统砂锅煎药，具有化学性质稳定、传热快、导热均匀、散热慢、火候大小可随意调节、水分蒸发量小等特点。由于实验室条件的限制，本研究采用可调温电热套加热玻璃烧瓶替代传统砂锅煎药方式，玻璃烧瓶化学性质稳定、传热快，可调温电热套导热均匀、散热慢，且火候大小可随意调节，先大功率煮沸，再调小加热功率，保持微沸，水分蒸发量小，两者联合使用可较好地模拟传统的砂锅煎煮。

此外，银翘散挥发性成分的组成和香味的构成均极为复杂，低含量成分可能对香气的贡献值较大，由于实验条件的局限，本研究仅以其中的3种指标性成分薄荷酮、薄荷脑和胡薄荷酮含量变化来表征香气浓淡变化尚有不足之处，有待进一步完善，笔者将采用电子鼻等技术手段量化香气，为进一步阐明银翘散“香气大出即取服”的科学内涵提供科学依据。