2，3，7，8—四氯二苯并—p—二恶英对建鲤肝组织损伤作用研究

杜金梁　曹丽萍　贾睿　刘英娟　赵才源　申玉金　丁炜东　殷国俊

摘要：利用精密肝切片培养技术研究2，3，7，8-四氯二苯并-p-二恶英（TCDD）对建鲤肝组织的损伤作用，将精密肝切片组织分为5个处理组，每个处理组4个重复，将不同浓度TCDD（浓度设定为0.00、0.05、0.10、0.30、0.60μg/L）处理肝切片3 h后，收集上清培养液及肝切片组织测定丙氨酸转氨酶（GPT）、天冬氨酸转氨酶（GOT）、乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（sOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、三磷酸腺苷（ATP）等生化指标含量变化。结果表明：TCDD浓度在0.30μg/L时，对精密肝切片组织损伤较大，可以显著提高上清培养液中GPT、GOT、MDA的含量，显著提高切片匀浆上清液中LDH的活性值，与空白对照组相比，差异极显著（P<0.01）；可以显著降低切片匀浆上清液中ATP、GSH-PX的含量，与空白对照组相比，差异极显著（P<0.01）；显著降低上清培养液中SOD活性值，与空白对照组相比，差异显著（P<0.05）。这说明采用TCDD进行急性染毒后，可以造成建鲤肝组织的损伤，使机体组织处于氧化应激状态，产生一系列氧化应激反应。

关键词：2，3，7，8-四氯二苯-p-二恶英（TCDD）；精密肝切片；建鲤；毒性机理

中图分类号：S941.8 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0248—03

二恶英为三环芳香族化合物，是一类多种化合物的统称，能够持续危害自然界环境和生物体。而2，3，7，8-四氯二苯-p-二恶英（TCDD）是其中毒性最强的一类物质，目前关于TCDD的研究主要涉及自然界环境以及哺乳动物方面，涉及到鱼类的研究相对较少。在水产方面报道主要有黄金华等对2，3，7，8-四氯二苯并-p-二恶英（TCDD）对鱼类功能基因表达的研究，许友卿等对2，3，7，8-四氯二苯并-p-二恶英对鱼类生长的影响，关于TCDD对鱼类肝组织受TC-DD损伤的研究鲜有报道。鱼类对水体污染较敏感，鱼组织吸收了污染物TCDD后会影响其许多生理和生化作用，且TCDD进入机体后首先是在肝脏进行解毒和生物转化，机体肝脏是一个重要的解毒器官。由于TCDD的毒性强、危害大，关于其毒性机理尚未弄清，难以防治，给水产养殖业带来较大的负面影响。因此，一方面应该积极防止和减少TCDD的产生和污染，另一方面努力深入研究TCDD的毒性及其机制，为防治TCDD毒害提供技术依据。

目前，有很多毒物可以引起机体的氧化应激反应，但TCDD是否会引起鱼类肝组织的氧化应激反应尚不清楚，因此本研究以建鲤为试验材料，利用不同浓度TCDD处理建鲤肝组织切片，来研究TCDD对鱼类肝组织的毒害作用，為以后研究TCDD对鱼类毒害机制研究奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验鱼 试验用建鲤取自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心渔场，体质健康、无伤，取回后将建鲤于循环水系统中暂养1周。

1.1.2试剂和仪器 L15培养基、HBSS（Hanks，balanced sault solution）溶液、庆大霉素和两性霉素B（购自美国SIGMA公司）；新生小牛血清（FCS）（浙江天杭生物科技有限公司）和细胞培养板（GIBCO公司）；2，3，7，8-四氯二苯-p-二恶英（厦门慧嘉生物科技有限公司）；GPT、GOT、LDH、GSH-PX、ATP、MDA和SOD测定试剂盒（南京建成生物工程研究所科技有限公司）；MS一222麻醉剂（购自美国SIGMA公司）；723分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）；酶标仪MK3（美国Thermo公司），KD-400切片机（购自浙江金华科迪仪器有限公司）。

1.2方法

1.2.1建鲤精密肝切片的制备 选取健康无病体质量在800～1 500 g的建鲤来进行试验，采用MS-222麻醉。无菌采取肝脏后放人冷的L15培养基中（50μg/ml庆大霉素和2.5 mg/mL两性霉素B），修整肝组织块，选取5 mm×5 mm的肝组织块来进行切片，切片厚度为300μm，选取完整切片置于24孔培养板中，每组4孔，每孔6片，置于27℃、5%体积分数CO₂条件下培养备用。

1.2.2 TCDD诱导精密肝切片损伤模型制备 将获得的精密肝切片预培养30 min后，弃掉培养液换用含不同浓度（0.00、0.05、0.10、0.30、0.60μg/L）的TCDD进行处理，继续培养3 h。然后收集上清培养液以及肝切片进行GOT、GPT、LDH、GSH-PX、MDA、SOD等指标测定。

1.2.3 ATP含量的测定 收集不同浓度（0.00、0.05、0.10、0.30、0.60μg/L）TCDD处理的精密肝组织切片来进行ATP含量的测定，具体操作方法参照试剂盒说明书。

1.2.4建鲤精密肝切片上清培养液中SOD、GPT、MDA、GOT的测定 将收集精密肝切片上清培养液按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书操作方法进行各项指标测定。

1.2.5精密肝组织切片匀浆上清液中LDH和GSH-PX含量的测定 收集肝组织切片进行匀浆液制备，按照切片质量与生理盐水1：9比例制备成10%的组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液用于LDH和GSH-PX的测定。

1.2.6统计学处理 所有数据均用SPSS 16.0软件进行处理。采用One-Way ANOVA检验法进行显著性分析，结果以平均值±标准差表示，对样本间进行t检验，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2结果与分析

2.1 TCDD对精密肝组织切片活力的影响

由图1可知，加入不同浓度的TCDD后，ATP含量呈下降趋势，且随着药物浓度的不断加大，其含量下降越明显，TCDD浓度在0.30、0.60μg/L时，与空白对照组相比差异极显著（P<0.01）。

2.2 TCDD对精密肝切片培养液中GPT、GOT活性的影响

由图2-A可知，切片经过TCDD处理，GPT活性值明显升高，其浓度在0.10、0.60μg/L时，GPT活性值与空白对照组相比显著升高（P<0.05）；TCDD浓度在0.30μg/L，GPT活性值与空白对照组相比极显著升高（P<0.01）。由图2-B可知，在TCDD浓度达到0.30μg/L时，GOT活性值与空白对照组相比极显著升高（P<0.01）。

2.3 TCDD对精密肝切片匀浆上清液中LDH活性的影响

由图3可知，LDH活性值有随着药物浓度增加而升高趋势，TCDD浓度在0.10μg/L时，LDH活性值与空白对照组相比显著升高（P<0.05）；TCDD浓度达到0.30μg/L时，LDH活性值与空白对照组相比极显著升高（P<0.01）。

2.4 TCDD对精密肝切片培养液中SOD、MDA含量的影响

由图4可知，TCDD处理后的SOD活性值呈降低趋势，当浓度在0.30μg/L时，SOD活性值与空白对照组相比显著降低（P<0.05）；当浓度在O.60μg/L时，SOD活性值与空白对照组相比极显著降低（P<0.01）。TCDD处理后的MDA含量呈升高趋势，有随着浓度加大其含量不断增加趋势，TCDD浓度在0.10、0.30μg/L，MDA含量与空白对照组相比极显著增加（P<0.01）。

2.5 TCDD对精密肝切片匀浆上清液中GSH-PX含量的影响

由图5可知，经过TCDD处理后，随着TCDD浓度的加大，其活性值在不断下降，在TCDD浓度为0.30、0.60μg/L时，GSH-PX含量与空白对照组相比极显著降低（P<0.01）。

3讨论

精密肝切片培养技术是一种介于器官和细胞之间的试验手段，由于具有制片相对简单、能保证组织完整性等特点，此项技术被国内外广泛应用于药物筛选过程中，但精密肝切片技术也有它自身的缺点，不如肝细胞培养时间长。对水产动物而言，国内外没有应用鱼类肝精密组织切片技术来研究TCDD损伤机制的报道，本实验室成功研制了鱼类精密肝切片培养技术，为以后了解药物对鱼类肝组织损伤研究提供了一种新的技术手段。

有相关报道称TCDD可以促使机体发生氧化應激反应，如使脂质过氧化产物MDA含量增加，抗氧化酶指标SOD、GSH-PX等活力下降。经过TCDD处理后所产生的一系列氧化应激反应具体作用机制是由于TCDD与机体内的芳香烃受体AHR结合后，改变了一些酶的活性和蛋白质。正常情况下，氧自由基在机体内是不断产生并不断清除的，当遇到毒物刺激时，机体就会产生氧自由基，如果产生氧自由基过多，机体来不及进行自身代谢来消除，就会引起机体的抗氧化体系失去平衡，进而引起机体组织损伤。GOT、GPT是判定肝组织健康状态的经典指标，被广泛应用到肝损伤模型的构建当中，如在本试验中，加入不同浓度的TCDD后发现，肝切片上清培养液中GOT、GPT活性值明显升高，这说明TCDD可以引起肝切片组织的损伤，使GOT、GPT这2个酶学指标不断从机体中释放出来，加重了肝组织的损伤，TCDD浓度在0.30μg/L时其活性值达到一个高点，与空白对照组相比，差异显著（P<0.01）。当TCDD浓度达到0.60μg/L时其活性值出现下降的趋势。LDH存在于机体细胞的胞质内，如果机体受到损伤，其含量也会发生一定的变化，在本试验中TCDD浓度在0.10、0.30μg/L时，其活性值明显增加，这说明切片肝组织受到了TCDD的攻击，因而造成其数值发生变化。本试验结果与前人结果类似。

ATP是机体内重要的能量分子，它在机体生理和病理过程中发挥着重要作用，当机体处于病理或毒物刺激时，其含量就会下降，依此来判断机体的健康水平。在本试验中主要应用于判定切片的活性水平，当用不同浓度TCDD处理切片组织后发现，ATP含量随着药物浓度不断加大而逐渐降低，TCDD浓度在0.3、0.6μg/L时，其含量值最低，与空白对照组相比，差异极显著（P<0.01），这说明随着药物浓度的加大，肝切片活力下降。

当机体受到自由基攻击后就会出现脂质过氧化反应，MDA就是其中一个判定指标，其含量高低反映了机体受损伤程度，可以准确反映脂质过氧化程度。而SOD、GSH-PX这2个指标属于抗氧化酶体系，其含量变化反映的是机体抗氧化能力的高低。在本试验中，经过TCDD处理后，SOD、GSH-PX活性值随着药物浓度的增加呈逐渐降低趋势，TCDD浓度达到0.30μg/L时，SOD、GSH-PX活性值明显下降，与空白对照组相比，差异显著或者极显著（P<0.05或P<0.01）；TCDD浓度达到0.60μg/L时，SOD、GSH-PX活性值明显下降，与空白对照组相比，差异极显著（P<0.01）。而MDA含量随着药物浓度增加不断增加，这说明建鲤肝组织损伤程度在不断加大。通过以上指标的测定说明TCDD使精密肝切片组织处于氧化应激状态，造成机体的损伤。

综上所述，TCDD可以造成鱼类肝组织的氧化应激反应，且在浓度为0.30μg/L时，精密肝切片组织的损伤较为严重，关于其具体毒性机制还有待于进一步研究。