利用基于单链抗体的BIAcore技术检测蔬菜中的杀螟硫磷残留

刘 珊，罗义辉

(重庆科技学院 化学化工学院，重庆 401331)

利用基于单链抗体的BIAcore技术检测蔬菜中的杀螟硫磷残留

刘 珊，罗义辉*

(重庆科技学院 化学化工学院，重庆 401331)

为建立一种基于单链抗体的蔬菜中杀螟硫磷残留快速检测方法，测定了前期通过核糖体展示所获得的抗杀螟硫磷单链抗体的亲和力和特异性，并建立了基于该抗体和BIAcore X系统检测蔬菜样品中杀螟硫磷的方法。结果表明，获得3株高亲和力单链抗体，其与杀螟硫磷的解离平衡常数分别为4.56×10-10、1.42×10-9、2.66×10-10mol/L，与除对硫磷外的其他有机磷农药的交叉反应率<0.1%(与对硫磷的交叉反应率≤2.8%)，说明获得的单链抗体对杀螟硫磷具有很高的特异性。样本添加回收率试验结果显示，该方法的平均回收率介于95.8%～102.2%，相对标准偏差(RSD)≤2.13%，说明该试验方法可靠，可用于实际蔬菜样品中杀螟硫磷的快速检测。

杀螟硫磷； 有机磷检测； 单链抗体； BIAcore

有机磷农药因能有效控制害虫生长，在农业生产中被广泛使用。杀螟硫磷属于毒性中等的有机磷杀虫剂，是常用的有机磷农药之一。农产品中有机磷农药残留引起的中毒事件时有发生，由于蔬菜生长周期较短，而有机磷分解需要一定的时间，蔬菜中有机磷的残留更加引起人们关注。目前，人们一般采用气相色谱或高效液相色谱等仪器分析法对蔬菜等农产品中的有机磷农药残留进行检测，但这些方法均需要复杂的前处理，因而耗时较多，对蔬菜等需要保鲜的农产品不太适合[1]。基于抗原-抗体特异反应的免疫分析由于具有灵敏、快速等特点，成为近年来农残检测的研究热点。

免疫分析的核心是高亲和力、高特异性抗体的获得。抗体通常分为多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体，单链抗体(ScFv)是重组抗体之一。由于单链抗体具有组织穿透力强、生产成本较低等特点，已被广泛应用于医学领域[2]。目前也有一些抗有机磷单链抗体的研究[3-5]。基于表面等离子共振(surface plasmare sonance，SPR)的BIAcore技术因其具有实时监测动态反应过程、无需对分子进行标记、样本用量少、易于自动检测、快速等优点，在分析测定核酸、蛋白质等大分子方面显示出了巨大的应用潜力[6-7]，近年来有较多应用BIAcore或SPR技术检测生物大分子的报道[7-11]。但尚无关于BIAcore检测农残的报道。为此，基于前期通过核糖体展示技术筛选获得的杀螟硫磷单链抗体和BIAcore技术，建立蔬菜中杀螟硫磷残留的快速检测方法，为蔬菜中有机磷农药残留的快速检测提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

仪器与试剂：BIAcore X系统、CM5芯片、HEPES缓冲溶液(GE公司)，Model 550酶标仪(Bio-Rad公司)，HisLinkTM蛋白纯化系统、卵清白蛋白(OVA)(Promega公司)，杀螟硫磷等有机磷农药标准品(国家标准物质中心)。

蔬菜样品：普通蔬菜样品(重庆市沙坪坝陈家湾菜市)、未使用农药蔬菜(重庆新陆农业开发有限公司有机蔬菜基地)。

1.2 单链抗体的再筛选

单链抗体的表达：将前期经过核糖体展示筛选所获得的杀螟硫磷ScFv基因[5]与载体pPOW3.0连接后转入大肠杆菌DH5α 进行小量表达。

单链抗体的再筛选：将筛选抗原杀螟硫磷-OVA与芯片CM5偶联后固定于BIAcore X,分别将ScFv表达所得到的蛋白质溶液(未纯化)注射入BIAcore X,记录单链抗体与杀螟硫磷的结合与解离过程，筛选获得高亲和力的抗体基因。

1.3 单链抗体亲和力分析

单链抗体蛋白的纯化：应用HislinkTM蛋白纯化系统将上一步结合-解离过程所得到的具有较强结合力的单链抗体蛋白进行纯化。

单链抗体亲和力分析: 用HEPES缓冲溶液将纯化后的单链抗体蛋白稀释，得到不同浓度梯度(8、4、2、1 nmol/L)的溶液，再将溶液分别注入BIAcore X，记录其与固定在芯片上的筛选抗原的结合-解离过程，用仪器自带软件分析单链抗体与杀螟硫磷的亲和力。

1.4 单链抗体特异性分析

用竞争酶联免疫分析测定上步筛选得到的高亲和力抗体与杀螟硫磷及其他有机磷农药的结合情况，分析抗体的特异性。

酶联免疫分析: 向酶联板每孔中加入100 μL质量浓度为20 μg/mL的单链抗体溶液(用磷酸盐缓冲溶液配制)，做3个平行，过夜放置。次日弃溶液，用洗涤液(含0.05% Tween 20 的磷酸盐缓冲液)洗板。用1%明胶于37 ℃封闭2 h，洗板。每孔加入不同浓度梯度的有机磷农药(杀螟硫磷、乐果、对硫磷、乙酰甲胺磷、毒死蜱、马拉硫磷、三唑磷)50 μL，37 ℃放置1 h，再加入50 μL质量浓度为100 μg/mL的杀螟硫磷-OVA，37 ℃放置1 h，洗板。加入100 μL辣根过氧化物酶标记的抗OVA抗体，37 ℃放置2 h，洗板。加入底物显色5～15 min，用硫酸终止，酶标仪读取OD450。

IC50(半抑制浓度)的获得：以有机磷农药浓度为横坐标、结合率(B/B0，B是对应浓度有机磷农药的OD450，B0是不加有机磷农药的OD450)为纵坐标，绘制标准曲线，通过标准曲线求得不同有机磷农药的IC50。

交叉反应率的计算：利用不同有机磷农药的IC50计算交叉反应率，计算公式如下。

1.5 蔬菜中杀螟硫磷的测定

标准曲线的建立：分别用磷酸盐缓冲溶液配制单链抗体浓度为10 nmol/L且含不同质量浓度梯度 (0、2、4、6、8、10 ng/mL) 杀螟硫磷的溶液，室温下放置2 h，使抗体与杀螟硫磷充分结合，再分别注入BIAcore X，流经表面有杀螟硫磷-OVA的CM5芯片，读取响应值(response unit，RU)，做3个平行，根据质量浓度和RU值绘制标准曲线。

蔬菜中杀螟硫磷的测定：将从菜市购买的番茄、黄瓜、大白菜捣碎，分别称取20 g，加入40 mL丙酮，振荡30 min，离心分离，取上清，旋转蒸发仪蒸干后，用100 mL的磷酸盐缓冲液溶解，取该溶液2 mL与48 mL含单链抗体的溶液混合，放置2 h，采用与建立标准曲线相同的方法测定RU值，做3个平行。

1.6 样本添加回收率试验

从重庆市有机蔬菜基地采摘未使用过农药的蔬菜样品(番茄、黄瓜、大白菜)，添加一定量(0.20、2.0、20 mg/kg)的杀螟硫磷，进行样本添加回收率试验，各做5个平行，测定平均回收率和相对标准偏差(RSD)。

2 结果与分析

2.1 单链抗体的再筛选

作为对比，分别从经过和未经过核糖体展示筛选的单链抗体文库中随机挑取9个克隆子，经大肠杆菌DH5α 表达抗体蛋白(均未纯化)后逐一注射进BIAcore X，观察抗体蛋白是否与筛选抗原杀螟硫磷-OVA结合，所得结果如图1所示。从单链抗体原始文库随机挑选的9个抗体蛋白几乎不与杀螟硫磷-OVA结合(图1A)，而从经过核糖体展示筛选后的文库中随机挑选的9个蛋白有3个与杀螟硫磷-OVA有较强的结合，1个有较弱的结合(图1B)。

A.原始文库；B.核糖体展示筛选后的文库；

2.2 高亲和力单链抗体的筛选

利用上述方法从190个抗体基因中筛选到10个亲和力较高的基因，再将这10个基因所表达的抗体蛋白纯化，利用BIAcore X系统分析不同浓度梯度的抗体蛋白与筛选抗原的结合-解离过程(图2)。

图2 抗体蛋白梯度稀释后与抗原的结合情况

通过BIAcore X拟合结合-解离曲线获得抗体蛋白与筛选抗原的解离平衡常数，解离平衡常数越小，说明抗体与抗原亲和力越强。据此，获得了3株高亲和力抗体ScFv-AF50、ScFv-AF93 和ScFv-AF132，解离平衡常数分别为4.56×10-10、1.42×10-9、2.66×10-10mol/L(表1)。

表1 3株抗体蛋白与抗原的作用常数

2.3 单链抗体的特异性

利用竞争ELISA测定了3株高亲和力抗体的选择性，分别利用结合率(B/B0)—浓度曲线获得杀螟硫磷及其他6种有机磷农药对3株抗体蛋白的IC50，再利用这些有机磷农药的IC50计算交叉反应率(表2)。从表2可以看出，3株抗体蛋白与对硫磷的交叉反应率稍大(≤2.8%)，与其他5种有机磷农药的交叉反应率都小于0.1%，说明所获得的抗体蛋白对杀螟硫磷具有很高的特异性。抗体蛋白与对硫磷的交叉反应率稍大，可能是由于对硫磷与杀螟硫磷结构相似，后者仅比前者多1个甲基(表2)。

表2 单链抗体蛋白与有机磷农药的交叉反应率 %

续表2 单链抗体蛋白与有机磷农药的交叉反应率 %

2.4 蔬菜中的杀螟硫磷残留量测定

选择结合力最强的ScFv-AF132抗体测定蔬菜中的杀螟硫磷。以不含杀螟硫磷的RU值与不同质量浓度下RU值之差RU为纵坐标，杀螟硫磷质量浓度C为横坐标，建立标准曲线，如图3所示。

图3 杀螟硫磷标准曲线

表3 蔬菜中杀螟硫磷含量

从表3可以看出，3种蔬菜中均有一定的杀螟硫磷残留，大白菜中的含量最高，但都低于国家标准GB 2763—2014对上述3种蔬菜中杀螟硫磷最大残留量的规定(0.5 mg/kg)[12]。

2.5 样品添加回收率

分别向番茄、黄瓜、大白菜3种蔬菜中添加0.20、2.0、20 mg/kg的杀螟硫磷，进行方法的回收率和精密度检验，测定结果如表4所示。从表4可以看出，不同蔬菜中杀螟硫磷的平均回收率介于95.8%～102.2%，RSD≤2.13%，说明试验方法可靠，可用于实际蔬菜样品中杀螟硫磷的快速检测。

3 结论与讨论

本研究将前期通过核糖体展示筛选获得的抗杀螟硫磷单链抗体基因进行表达，并对抗体蛋白进行纯化，利用BIAcore技术和酶联免疫分析研究了抗体的亲和力和特异性，初步建立了利用基于该单链抗体的BIAcore技术快速检测蔬菜中杀螟硫磷的方法。目前，国内对有机磷类农残的快速检测方法通常是酶抑制法，其优点是快速、简便，但也有灵敏度不高的缺点，有时会造成漏检，因为酶抑制法检测的有效范围与农残标准属同一数量级(mg/kg)[13]。而免疫分析法检测的有效范围与气相色谱法相同，均可达μg/kg数量级，本研究所建立的杀螟硫磷检测方法将免疫分析法与BIAcore技术相结合，使之比通常的免疫分析法(如酶联免疫分析)更精确、更快速。利用该方法筛选获得的单链抗体对杀螟硫磷的解离平衡常数最小值为2.66×10-10mol/L，而以前的研究者通过噬菌体展示所获得的抗甲胺磷单链抗体的解离平衡常数最小值为1.24×10-8mol/L[14]，说明本研究所获得的单链抗体具有更高的亲和力。样本添加回收率试验结果显示，该方法的平均回收率介于95.8%～102.2%，RSD≤2.13%，表明本研究的试验方法可靠，可用于实际蔬菜样品中杀螟硫磷的快速检测。然而，该方法还存在单链抗体需低温保存、BIAcore不适合蔬菜的田间分析等缺点，在进一步的研究中需要加以克服。

[1] 杨眉,陈学敏,李钰,等.分子印迹传感技术在农药残留检测中的应用研究进展[J].农药学学报,2016,18(2):151-157.

[2] Yuan Q,Xia Y X.Selection of single chain fragments against the phytopathogenXanthomonasaxonopodispv.citriby ribosome display[J].Enzyme and Microbial Technology,2007,41:383-389.

[3] 周丽君,黄启欣,雷红涛,等.二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药单链抗体的制备及广谱特异性[J].高等学校化学学报,2012,33(10): 2269-2274.

[4] 罗义辉,罗天培.抗有机磷农药单链抗体cDNA文库的构建与鉴定[J].河南农业科学，2014,43(5)：97-101.

[5] Luo Y H,Xia Y X.Selection of single-chain variable fragment antibodies against fenitrothion by ribosome display[J].Analytical Biochemistry,2012,421(1):130-137.

[6] 李娅慧.表面等离子共振生物传感器快速检测点突变的新方法研究[D].重庆：重庆医科大学,2014.

[7] Roos H，Markey F,Elwinger F.Evaluation of calibration-free concentration cnalysis provided by BiacoreTMsystems[J].Analytical Biochemistry,2016,510:88-97.

[8] Altintas Z,France B,Ortiz J O.Computationally modelled receptors for drug monitoring using an optical based biomimetic SPR sensor[J].Sensor Actuat B-Chem,2016,224(3):726-737.

[9] Levanon N L,Vigonsky E,Lewinson O.Real time measurements of membrane protein: Receptor interactions using surface plasmon resonance(SPR)[J].J Vis Exp,2014,93(11):e51937.

[10] Brzozowska E,Koba M,Smietana M,etal.Label-free gram-negative bacteria detection using bacteriophage-adhesin-coated long-period gratings[J].Biomedical Optics Express,2016,7(3):829-840.

[11] Liang Y H,Chang C C,Chen C C.Development of an Au/ZnO thin film surface plasmon resonance-based biosensor immunoassay for the detection of carbohydrate antigen 15-3 in human saliva[J].Clinical Biochemistry,2012,45:1689-1693.

[12] 农业部,国家卫生计生委.食品中农药最大残留限量：GB 2763—2014[S].北京：中国标准出版社，2014:151.

[13] 朱松明，周晨楠，和劲松，等.基于酶抑制法的农药残留快速比色检测[J].农业工程学报，2014，30(6)：242-248.

[14] Li T,Zhang Q,Liu Y，etal.Production of recombinant ScFv antibodies against methamidophos from a phage-display library of a hyperimmunized mouse[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54:9085-9091.

Detection of Residual Fenitrothion in Vegetable Samples by BIAcore Based on Single Chain Antibody

LIU Shan，LUO Yihui*

(College of Chemistry and Chemical Engineering,Chongqing University of Science and Technology,Chongqing 401331,China)

For establishing a method to fast measure residual fenitrothion in vegetables based on single chain antibody,the affinity and specificity of single chain variable fragments(ScFvs) against fenitrothion selected by ribosome display in our preliminary study were tested,and then a method for detection of residual fenitrothion in real vegetable samples by BIAcore X system based on the ScFvs was established.The results showed that three ScFvs of high affinity were obtained,the equilibrium dissociation constants with fenitrothion were 4.56×10-10，1.42×10-9，2.66×10-10mol/L,respectively,and the cross-reactivity with other organophosphorus pesticides was below 0.1% except for parathion-methyl(≤2.8%),which indicated that the ScFvs had a high specificity for fenitrothion.Recoveries of fenitrothion from fortified vegetables were in the range of 95.8%—102.2% and the relative standard deviation(RSD) was below 2.13%.The results above indicated that this method was reliable,and could be used for fast measuring residual fenitrothion in real vegetable samples.

fenitrothion; detection of organophosphorus; single chain antibody; BIAcore

2016-10-31

国家质量监督检验检疫总局公益性行业科研专项(2012104003)

刘 珊(1996-),女，重庆人，在读本科生，研究方向：化学品分析检测。E-mail：1218881597@qq.com

*通讯作者：罗义辉(1966-)，男，四川武胜人，讲师，博士，主要从事有害化学品快速检测研究。 E-mail：383 620 115@qq.com

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1004-3268(2017)05-0095-05