黄芪和板蓝根超微粉的粒径观察及其抗鸡新城疫病毒效果

于明鹤,史秋梅,柴铁瑛,柴楠楠,王会敏,高光平,高桂生,张艳英,高景龙

(1.文安县畜牧兽医局，河北 文安 065800； 2.河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北 昌黎066600；3.承德县农牧局，河北 承德 067499； 4.中红三融集团有限公司，河北 承德 067499)

黄芪和板蓝根超微粉的粒径观察及其抗鸡新城疫病毒效果

于明鹤1,史秋梅2*,柴铁瑛3,柴楠楠3,王会敏3,高光平2,高桂生2,张艳英2,高景龙4

(1.文安县畜牧兽医局，河北 文安 065800； 2.河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北 昌黎066600；3.承德县农牧局，河北 承德 067499； 4.中红三融集团有限公司，河北 承德 067499)

为探讨黄芪、板蓝根超微粉的抗病毒作用，应用激光粒度分析仪和扫描电镜观察了黄芪和板蓝根超微粉的粉体粒度及其破壁情况，通过鸡胚接种试验观察2种中草药超微粉对鸡新城疫病毒的抑制作用。结果表明：黄芪和板蓝根超微粉的粒度分布中心D50分别为10.10 μm和8.31 μm；2种中草药超微粉的破壁情况良好，电镜下只能观察到不完整的细胞壁，为组织碎片。黄芪和板蓝根超微粉对新城疫病毒最小抑制剂量分别为1 562.5、781.2 μg/mL，以板蓝根抗病毒效果较好。

黄芪； 板蓝根； 超微粉； 新城疫病毒

中草药的超微粉碎可将细胞打碎，细胞破壁率高达95%，细胞经破壁后，胞内有效成分可充分暴露出来，使储存于细胞内和细胞间的有效成分直接接触到提取溶剂，或直接与机体受体结合，发挥治疗效果[1]。研究证实,许多中草药具有增强免疫力、抑制和杀灭病原微生物的作用[2-3]。黄芪具有促进机体体液免疫和细胞免疫的功能,可抑制和杀灭微生物。黄芪多糖能促进机体产生抗病毒干扰素,抑制病毒蛋白的合成,从而使机体产生抗病毒感染的作用[4-7]。板蓝根作为清热解毒药,可直接作用于免疫系统的免疫器官、免疫细胞及其分泌的抗体、细胞因子，对免疫系统进行调节, 通过提高机体免疫功能激发机体自身的抗菌、抗病毒、抗氧化作用[8-9]。为进一步验证黄芪和板蓝根对微生物在动物体外的杀灭和抑制作用, 以黄芪和板蓝根为供试药物,应用激光粒度分析仪和扫描电镜观察了黄芪和板蓝根超微粉的粉体粒度及其破壁情况，通过鸡胚接种试验观察了2种中草药超微粉对鸡新城疫病毒(NDV)的抑制作用，旨在为黄芪、板蓝根的临床应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

鸡胚、中药、毒株：8～10日龄鸡胚(北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)、黄芪和板蓝根超微粉(河北省某中药厂制备)、NDV 标准毒株F48E8株(中国兽药监察所)。

仪器：JL9200激光粒度分析仪(青岛市平度华宝电气有限公司)、KYKY-2800扫描电镜(北京中科科仪技术发展有限责任公司)、SCB-12小型离子试射仪(上海民仪电子有限公司)。

1.2 黄芪、板蓝根超微粉粉体粒度及破壁观察

取适量黄芪和板蓝根超微粉分别用无水乙醇进行分散，将分散后的粉体混悬液加入JL9200激光粒度分析仪的测定杯中，按操作说明进行黄芪、板蓝根超微粉粉体粒度的测定。测定的粉体颗粒大小即颗粒粒度用D表示，分别表示为D10、D25、D50、D75、D90，D50为中位径或中值粒径，表示1个样品的累计粒度分布百分数达到50%时所对应的粒径，常用来表示粉体的平均粒度。用银针将黄芪和板蓝根超微粉分别拨散在碳双面胶带上，在SCB-12小型离子试射仪中喷镀黄金4～5 min，黄金厚度约1.5×10-7cm，最后以20 kV的加速电压，在KYKY-2800扫描电镜下观察其超微结构和破壁情况。

1.3 黄芪、板蓝根超微粉抗病毒试验

1.3.1 NDV标准毒株鸡胚半数感染量(EID50)的测定 参照文献[10]的方法进行NDV增殖，计算EID50。将NDV标准毒株F48E8株按照10倍梯度连续稀释9个稀释度，取101～109稀释度的病毒液接种于10日龄鸡胚，每个稀释度接种4枚鸡胚，每枚鸡胚接种0.1 mL，另设4枚鸡胚为空白对照。将鸡胚置于37.5 ℃恒温箱中孵化，经10 h间隔照蛋，弃去死亡鸡胚。连续观察4 d，每天观察鸡胚发育情况，将24 h后死亡及96 h时未死的鸡胚放入4 ℃冰箱中冻存、过夜，收集尿囊液，测定血凝效价，按Reed-Muench法计算EID50。

1.3.2 黄芪、板蓝根超微粉提取液最大安全质量浓度的测定 将黄芪和板蓝根超微粉用70 ℃温水溶解成1 g/mL储存质量浓度，分装提取液，于121 ℃高压灭菌30 min，4 ℃保存备用。将黄芪、板蓝根超微粉提取液用生理盐水分别进行100倍稀释，之后再进行连续2倍倍比稀释，取连续5个稀释度的稀释液(100×21～100×25)接种10日龄鸡胚，每个稀释度接种2枚鸡胚，每枚鸡胚接种0.2 mL，另设2枚鸡胚为空白对照(接种生理盐水)。将鸡胚置于37.5 ℃恒温箱中孵化，经10 h间隔照蛋，弃去死亡鸡胚。观察鸡胚发育情况，记录死胚情况。24 h后鸡胚全部存活(并结合鸡胚发育情况)的最高药液质量浓度为药物对鸡胚的最大无毒质量浓度，该剂量即为对鸡胚的最大安全质量浓度。

1.3.3 黄芪、板蓝根超微粉提取液对NDV的抑制作用测定 将黄芪和板蓝根2种单味中草药稀释，每种药物稀释5个梯度质量浓度，用1 mL灭菌注射器分别吸取100×EID50的NDV和不同稀释梯度的单味中草药提取液各1 mL，置于10个灭菌的小青霉素瓶中，混匀后置于37.5 ℃恒温箱作用30 min。按参考文献[11]的方法先将鸡胚分为病毒组、中草药病毒组和空白对照组。病毒组每胚尿囊腔接种0.1 mL病毒液和0.1 mL生理盐水，中草药病毒组每胚尿囊腔接种0.2 mL的病毒中草药混合液，空白对照组每胚尿囊腔接种0.2 mL生理盐水。接种后96 h收取尿囊液，测定NDV的血凝效价并观察胚体变化。血凝试验采用微量凝集法，判定标准参照文献[11-12]的方法。与空白对照组相比，血凝滴度相差5个或以上滴度的中草药剂量为对NDV的最小抑制剂量。

2 结果与分析

2.1 黄芪超微粉粉体粒度的分布情况

从表1可以看出，81.13%的黄芪超微粉粉体集中在1.981～88.583 μm，≤1.981 μm的粉体只占3.62%，≥88.583 μm的粉体占15.25%，粉体粒度分布中心D50为10.10 μm。粒径最大的粉体可达344.206 μm，但在229.075～344.206 μm的粉体还不到1%。

表1 黄芪超微粉粉体粒度的分布情况

注:D10=3.01 μm，D25=5.22 μm，D50=10.10 μm，D75=26.23 μm，D90=130.12 μm。

2.2 板蓝根超微粉粉体粒度的分布情况

从表2可以看出，78.31%的板蓝根超微粉粉体集中在1.981～17.377 μm，≤1.981 μm的粉体占3.82%，≥17.377 μm的粉体占17.87%，粉体粒度分布中心D50为8.31 μm。粒径最大者可达174.616 μm,在101.460～174.616 μm的粉体占全部粉体的1.13%。

表2 板蓝根超微粉粉体粒度的分布情况

注：D10=3.10 μm，D25=5.22 μm，D50=8.31 μm，D75=14.53 μm，D90=25.11 μm。

2.3 黄芪、板蓝根超微粉破壁情况的电镜观察结果

在扫描电镜下可以看到，黄芪和板蓝根微粉均匀分布,均看不到完整的药物组织结构，细胞形态不完整,只能看到组织碎片，且2种粉体的超微结构无明显区别(图1、2)。

2.4 黄芪、板蓝根超微粉体外抗病毒试验结果

2.4.1 EID50的测定结果 鸡胚接种NDV 72 h后，105稀释度的病毒液组有1枚鸡胚死亡，106～109稀释度的病毒液组鸡胚无死亡，按Reed-Muench法计算EID50，NDV病毒液105倍稀释时的EID50为0.1 mL。

图1 黄芪超微粉在扫描电镜下形态

图2 板蓝根超微粉在扫描电镜下形态

2.4.2 黄芪、板蓝根超微粉提取液最大安全质量浓度 由表3可知，黄芪提取液在100×21～100×22稀释度时,鸡胚死亡或发育不良；在100×23稀释度时，对鸡胚发育无影响。黄芪提取液最大安全质量浓度为2 500 μg/mL。板蓝根提取液在100×21～100×22稀释度时，鸡胚发育不良；在100×23稀释度时，对鸡胚发育影响不明显，毒性不大。板蓝根提取液最大安全质量浓度为1 875 μg/mL。

表3 中草药提取液对鸡胚最大安全质量浓度测定结果

注：括号内为鸡胚数量。

2.4.3 黄芪、板蓝根超微粉对NDV的抑制作用 空白对照组胚体发育良好；病毒组胚体发育不良，头颈、四肢出血，60 h达到死亡高峰，72 h全部死亡；药物病毒组，随着药物质量浓度的降低，胚体的头颈、四肢出血程度呈加重趋势。黄芪和板蓝根对NDV的最小抑制剂量分别为1 562.5、781.2 μg/mL(表4)。

表4 鸡胚接种法筛选中草药对NDV抑制作用的结果

3 结论与讨论

将中草药材粉碎至能通过筛孔内径为47 μm筛网，综合细胞尺度破壁率可达到86.5%以上。黄芪和板蓝根超微粉的粒度分布中心分别为10.10 μm和8.31 μm，远远小于47 μm筛的内径。因此，从理论上讲，本试验所用的黄芪和板蓝根超微粉的破壁率应高于86.5%。通过电镜观察发现，黄芪和板蓝根超微粉均看不到完整的细胞形态，只能观察到组织碎片。这说明本试验所用的黄芪和板蓝根超微粉的破壁率在90%以上。史万玉等[13]应用JL 9200激光粒度分析仪和扫描电镜对黄芪和淫羊藿2种中草药超微粉的粉体粒度及其破壁情况进行研究发现，这2种中草药超微粉的粒度分布中心D50分别为6.82 μm和8.40 μm，且2种中草药粉体90%以上的粒径大小均未超过40.72 μm。中药中80%是以植物药为主的，植物类药材的有效成分多贮存在细胞内，中草药超微粉碎技术是指利用机械或流体动力将3 mm以上物料颗粒粉碎至粒径为30 μm以下的过程，可打破植物药材细胞壁，使细胞内的有效成分充分释放出来，从而提高药材的生物利用度，有利于畜禽机体对药物的吸收利用。

NDV具有2种囊膜糖蛋白,即F、HN糖蛋白[14-16]。其中，HN糖蛋白既具有神经氨酸酶活性，也具有血凝性，通过HN糖蛋白与动物红细胞表面的相应受体结合,可使红细胞发生凝集，根据这一特性，所建立的血凝试验已成为检测NDV效价的主要方法。将黄芪和板蓝根超微粉制成液剂，各含原生药1 g/mL，通过鸡胚接种观察了2种中草药对NDV的抑制作用，用血凝试验检测了2种中草药对NDV的抗病毒作用，发现2种中草药对NDV有不同程度的抑制作用，黄芪和板蓝根对NDV的最小抑制剂量分别为1 562.5 μg/mL和781.2 μg/mL，板蓝根的最小抑制剂量小于黄芪的最小抑制剂量，以板蓝根抑制效果较好。黄芪和板蓝根是兽医临床上常用的2种中草药，用于增强畜禽的免疫力和抗病毒感染，本试验结果也显示，板蓝根、黄芪对NDV的增殖有一定的抑制作用，其中板蓝根作用相对较强。此外，值得提出的是，药物的抗病毒活性与药物的剂量有直接关系。在鸡胚可耐受的剂量下，随着药物稀释倍数的增加，其对病毒的抑制作用逐渐减弱。

[1] 叶惠珍.超微粉碎对中药方剂药效的影响[J].医药导报,2011,30(7):891-895.

[2] Levy D E,Garcia-Sartre A.The virus battles:IFN induction of the antiviralst ate and mechanisms of viral evasion [J].Cytokine Growth Factor Reviews,2001,12(2/3):143-156.

[3] Donnan S,Holland S M.Interferon-gamma and in terleuk 12 pathway defects and human disease[J].Cytokine Growth Factor Reviews,2000,11(4):321-323.

[4] 李丽娅,凌秋,崔洪波,等.黄芪多糖抗流感病毒的试验研究[J].中国中医药科技,2002,9(6):354-355.

[5] 郭小清,唐莉苹,杜海.黄芪多糖的药理作用及其在畜禽保健中的应用[J].中国动物保健,2004(3):45-47.

[6] 李宏全.黄芪多糖提高鸡抗氧化作用对免疫功能的影响[J].山西农业大学学报,2002,22(1):78-81.

[7] 陈芳艳,梁永彬,王林川,等.黄芪多糖提取方法的研究[J].广东畜牧兽医科技,2004,29(5):37-38.

[8] 史玉荣,张立华,谢广茹,等.甘草多糖的体内抑瘤及其机制的研究[J].临床肿瘤学杂志,2003,8(2):85-87.

[9] 许琳,王天益.清热药抗畜禽病毒感染的机理研究进展[J].中国兽医杂志,2003,39(5):20-21.

[10] 殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社,1997:329-330．

[11] 史秋梅,沈萍,陈丽凤,等.筛选抗病毒中草药的研究[J].中国动物保健,2003(9):22-23,29．

[12] 张慧茹,焦志强,崔斓斓,等.中草药组合物抗鸡新城疫病毒的效果研究[J].河南农业科学,2014,43(5):156-159.

[13] 史万玉,林德贵,钟秀会,等.黄芪和淫羊藿超微粉粉体粒度及破壁情况研究[J].动物医学进展,2005,26(6):78-80.

[14] 胡振宇,赵瑞瑞,卢慧,等.新城疫病毒感染宿主免疫应答及其抗肿瘤作用的研究进展[J].河南农业科学,2016,45(5):7-12.

[15] 阮涛,孙国鹏,王丽,等.新城疫病毒xx08株HN蛋白主要抗原区的原核表达及其在抗体检测中的应用[J].河南农业科学,2015,44(1):121-125.

[16] 张训海,朱鸿飞,周功强,等.鸡新城疫强毒株的分离及其人工感染试验[J].中国预防兽医学报,2002,24(3):212-215．

Size Observation and Anti-NDV Activity of Ultrafine Particle ofRadixAstragaliandRadixIsatidis

YU Minghe1，SHI Qiumei2*，CHAI Tieying3，CHAI Nannan3，WANG Huimin3， GAO Guangping2，GAO Guisheng2，ZHANG Yanying2，GAO Jinglong4

(1.Wenan Animal Husbandry and Veterinary Bureau,Wenan 065800,China; 2.Hebei Normal University of Science & Technology,Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine of Hebei Province,Changli 066600,China; 3.Bureau of Agriculture and Husbandry of Chengde County, Chengde 067499,China; 4.Zhonghong San Rong Group Co.,Ltd.,Chengde 067499,China)

To investigate the antiviral effect of ultrafine powders ofRadixAstragaliandRadixIsatidis,the size and the broken wall of ultrafine powders ofRadixAstragaliandRadixIsatidisby laser particle size analyzer and scanning electron microscope were observed and the inhibitory effects on Newcastle disease virus(NDV) were observed through the inoculation of chicken embryo.The results showed that the partical size distribution center D50of ultrafine powders ofRadixAstragaliandRadixIsatidiswere 10.10 μm and 8.31 μm,respectively.The broken wall condition was good,and the incomplete cell wall(pieces of tissues) could only be observed under electron microscope.The minimum inhibitory concentration to NDV ofRadixAstragaliandRadixIsatidiswere 1 562.5 μg/mL and 781.2 μg/mL respectively.The antiviral effect ofRadixIsatidiswas better.

RadixAstragali;RadixIsatidis; ultrafine particle; NDV

2016-11-22

科技部农业成果转化项目(2012GB2A200044)；河北省科技厅科技支撑计划项目(12220408D,14966610D)；河北省科技厅奖励性补助项目；承德市科技局计划项目(2015N0001)

于明鹤(1980-)，男，河北滦平人，兽医师，本科，主要从事动物传染病防治研究。E-mail:yuminghe2004@163.com

*通讯作者：史秋梅(1965-)，女，河北乐亭人，教授，博士，主要从事动物传染病防治研究。E-mail:shiqiumei@126.com

S859.3

A

1004-3268(2017)05-0140-04