柱后衍生阳离子交换色谱法同时测定新疆产贝母中17种氨基酸的含量Δ

艾则孜·莫合买提，沙丽娜，阿布力米提·伊力（.中国科学院新疆理化技术研究所，乌鲁木齐 800；2.中国科学院研究生院，北京 0009；.新疆食品药品检验所，乌鲁木齐 80000）

柱后衍生阳离子交换色谱法同时测定新疆产贝母中17种氨基酸的含量Δ

艾则孜·莫合买提1，2，3＊，沙丽娜3，阿布力米提·伊力1（1.中国科学院新疆理化技术研究所，乌鲁木齐 830011；2.中国科学院研究生院，北京 100039；3.新疆食品药品检验所，乌鲁木齐 830000）

目的：建立同时测定新疆产贝母中17种氨基酸含量的方法。方法：采用阳离子交换色谱柱分离17种氨基酸；采用柱后衍生阳离子交换色谱法测定药材中17种氨基酸的含量：色谱柱为LCAK 06/Na柱，流动相A为柠檬酸三钠11.9 g、柠檬酸6 g、苯酚1 g，加水溶解，再加65 mL甲醇和6 mL浓盐酸，加水定容（调pH至3.4），流动相B为柠檬酸三钠11.9 g、氢氧化钠2.8 g、苯酚1 g、硼酸5.0 g，加水溶解并定容（调pH至10.8）（梯度洗脱），流速为0.45 mL/min（A泵）、0.25 mL/min（M泵），检测波长为440 nm（脯氨酸）、570 nm（其余氨基酸），进样量为50 μL。结果：天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸和脯氨酸检测浓度线性范围均为20～400 nmol/mL（除胱氨酸10～200 nmol/mL）（r均大于0.989 0）；精密度、重复性、稳定性试验的RSD＜2.0%；检测限除胱氨酸外（0.08 nmol/mL）其余氨基酸均为0.16 nmol/mL；加样回收率为98.5%～99.5%（RSD为0.06%～0.21%，n＝6）。结论：该方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于新疆产贝母中氨基酸含量的同时测定。

贝母；氨基酸；柱后衍生化；阳离子交换色谱法

贝母是一种常用的药材，百合科Lilianceae贝母属Fritillaria多年生草本植物，其鳞茎可供药用，具有清热化痰、润肺止咳等功效，可用于肺热咳嗽、胸闷痰黏等症的治疗。在新疆分布量比较丰富的有新疆贝母F. walujewii Rgl[1-2]、伊犁贝母F.kpallidiflora Schrenk[3-4]、轮叶贝母F.tortifolia、黄花贝母F.verticillata、大白花贝母F.verticillata var.albidoflora、裕民贝母F.yuminensis、滩贝母F.karelinii和小花贝母F.meleagroides等，以上统称为新疆产贝母[1-4]。贝母主要成分为异甾生物碱、多糖和蛋白质等，其所含的氨基酸具有特殊的生物活性[5]。目前，对其生物碱成分报道较多，氨基酸的测定则较少见报道。为此，本试验对新疆产贝母中氨基酸进行了研究。

目前，国内外氨基酸分析方法主要分为直接分析法和衍生化间接分析法等两类。其中，衍生化方式又分为柱前、柱上和柱后衍生化等3种模式[6-9]。Sykam氨基酸分析仪广泛用于检测植物、动物中的氨基酸，主要采用柱后衍生模式，其基本原理与高效液相色谱法（HPLC）相似。同时，该方法对氨基酸分析进行了一系列细节的优化，如氮气保护、惰性管路、在线脱气、洗脱梯度及柱温梯度控制等。氨基酸分析仪使用时，通常利用Na+型或Li+型磺酸基强酸性阳离子交换树脂。由于氨基酸为两性电解质，在酸性条件下，能被树脂表面的活性基团（－SO3－）吸附，通过不同pH系列的洗脱液使氨基酸逐步洗脱下来，以氨基酸与活性基团亲和力最弱洗脱，即依次为酸性氨基酸、羟基氨基酸和中性氨基酸、芳香族氨基酸和碱性氨基酸等。Na+型树脂一般用于蛋白质水解液中的氨基酸分析；Li+型树脂一般用于生理体液中的氨基酸分析。本试验采用阳离子交换色谱法分离17种氨基酸，并采用柱后衍生化色谱法测定贝母中氨基酸的含量。

1 材料

1.1 仪器

S433D/S433型氨基酸分析仪，包括S5200全自动进样器、S4300氨基酸反应模块、S2100梯度泵（德国Sykam公司）；Delta 320台式酸度计、AG135型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；WG2003SBC型台式电热干燥箱（重庆四大实验仪器有限公司）；232 HK型高速离心机（德国Hermle公司）。

1.2 试剂

天冬氨酸（Asp）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、胱氨酸（Cys）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、组氨酸（His）、赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）混合对照品（批号：07070114-6006001，各氨基酸纯度均＞99.2%）、缓冲液A、缓冲液B、再生液、样品稀释液均购自德国Sykam公司；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 药材

10批贝母药材（见表1）经新疆维吾尔自治区食品药品检验所苏来曼·哈力克主任药师鉴定为真品。采集时间为2014－2015年。

表1 贝母药材来源Tab 1 Sources of Fritillariae Pallidiflorae Bulbus

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：LCAK 06/Na柱；流动相：流动相A（称取柠檬酸三钠11.9 g、柠檬酸6 g、苯酚1 g，置于1 L量瓶中，加适量水溶解，再加65 mL甲醇和6 mL浓盐酸，加水定容，调pH至3.4）、流动相B（称取柠檬酸三钠11.9 g、氢氧化钠2.8 g、苯酚1 g、硼酸5.0 g，置于1 L量瓶中，加水溶解并定容，调pH至10.8），梯度洗脱（0～8 min，100%A；8～15 min，100%→85%A；15～22 min，85%→80%A；22～27 min，80%→75%A；27～34 min，75%→0 A；34～51.1 min，0 A；51.1～51.2 min，0→100%A；51.2～65 min，100%A）；流速：0.45 mL/min（A泵）、0.25 mL/min （M泵）；检测波长：440 nm（Pro）、570 nm（其余氨基酸）；进样量：50 μL。

2.2 溶液的制备2.2.1 混合对照品溶液 精密量取混合氨基酸对照品适量，加样品稀释液制成Cys、其余16种氨基酸浓度分别为100、200 nmol/L的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 称取样品粉末约1.0 g，置于水解管中，加6 mol/L盐酸10 mL，通氮气封口，置于110 烘箱内水解24 h，取出放冷至室温，打开水解管，以半径为12 cm、3 000 r/min离心10 min，取上清液1.0 mL，置于蒸发皿中，挥尽盐酸，残渣加少量样品稀释液多次溶解并定容至20 mL，经微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。

2.3 系统适用性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。结果表明，在440、570 nm波长处，混合对照品溶液和供试品溶液中的氨基酸得到了很好地分离。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，加样品稀释液制成浓度为20、40、80、120、200、400 nmol/mL（Cys浓度为10、20、40、60、100、200 nmol/mL）的系列混合对照品溶液。精密量取上述系列混合对照品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测氨基酸浓度（x，nmol/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程与线性范围，详见表2。

表2 回归方程、线性范围与检测限Tab 2 Regression equations，linear range and limits of detection

2.5 检测限考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件进样测定，当信噪比为3∶1时，得检测限，详见表2。

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，17个待测氨基酸峰面积的RSD为0.03%～0.53%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：F10）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、10、12 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，17个待测氨基酸峰面积的RSD为0.62%～1.22%（n＝7），表明供试品溶液在室温放置12 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

精密称取同一批样品（编号：F10）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，17个待测氨基酸峰面积的RSD为0.07%～1.74%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量样品（编号：F10）适量，共6份，分别加入高、低浓度的待测氨基酸对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

2.10 样品含量测定

取10批样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表4。

表3 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 3 Results of recovery test（n＝6）

表4 样品含量测定结果（n＝3，%）Tab 4 Results of contents determination of samples（n＝3，%）

3 讨论

氨基酸分析在医药、食品和动植物代谢产品检测等方面应用非常广泛，国外早已开展了氨基酸HPLC检测方法的研究，国内也进行了这方面的探索。本试验采用柱后衍生阳离子交换色谱法测定氨基酸含量，定量结果比较可靠。

笔者对不同水解温度和时间（110 水解24 h，110 水解12 h，105 水解24 h）进行考察，结果110水解24 h较完全，样品水解时一定要水解充分，衍生时间足够；并且温度不可过低，否则将造成衍生不完全。

试验中所用的贝母来自不同年份同一采收季节，笔者分别测定了17种氨基酸的含量，其中有3种必须氨基酸的平均含量均大于0.5%，即Arg、Glu和Asp，尤其以Arg含量最高，这也说明贝母具有较高的药用价值。

综上所述，本方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于新疆产贝母中氨基酸含量的同时测定。

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Simultaneous Determination of Contents of 17 Amino Acids in Fritillariae Pallidiflorae Bulbus Produced in Xinjiang by Post-column Derivatization Cation-exchange Chromatography

Aziz·MOHAMMAT1，2，3，SHA Lina3，Ablumiti·YILI1（1.Xinjiang Technical Institute of Physics&Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Urumqi 830011，China；2.Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100039，China；3.Xinjiang Institute for Food and Drug Control，Urumqi 830000，China）

OBJECTIVE：To establish a method of contents determination of 17 amino acids in Fritillariae Pallidiflorae Bulbus produced in Xinjiang.METHODS：Cation-exchange column was used to separate 17 kinds of amino acids；post-column derivatization liquid chromatography was used to determine the contents of amino acids：the column was strong sulfonic acid cation exchange resin LCAK06/Na with mobile phase A（weighing trisodium citrate 11.9 g，citric acid 6 g，phenol 1 g，dissolving by water，then adding 65 mL of methanol and 6 mL of concentrated hydrochloric acid，bringing the volume with tap water，adjusting pH to 3.4），mobile phase B（weighing trisodium citrate 11.9 g，NaOH 2.8 g，phenol 1 g，boric acid 5.0 g，adding water to dissolve，adjustingpH to 10.8），gradient elution，flow rate was 0.45 mL/min for A pump and 0.25 mL/min for M pump，the detection wavelength was 440 nm for proline and 570 nm for the remaining amino acids，the injection volume was 50 μL.RESULTS：The linear range were 20～400 nmol/mL of aspartic acid，threonine，serine，glutamic acid，glycine，alanine，valine，methionine，isoleucine，leucine，tyrosine，phenylalanine，histidine，lysine，arginine，proline，10-200 nmol/mL of cystine（r were higher than 0.989 0）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；limits of detection were 0.16 nmol/mL except for cystine（0.08 nmol/ mL）；recovery was 98.5%-99.5%（RSD was 0.06%-0.21%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is simple with good precision，stability and reproducibility，and can be used for the simultaneous determination of amino acids in Fritillariae Pallidiflorae Bulbus produced in Xinjiang.

Fritillariae Pallidiflorae Bulbus；Amino acids；Post-column derivatization；Cation exchange chromatography

R927

A

1001-0408（2017）12-1680-04

2016-07-18

2016-09-02）

（编辑：张 静）

国家自然科学基金资助项目（No.U1403201）

＊主任药师。研究方向：药物分析。E-mail：Qabdas@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.12.27