肠易安汤对溃疡性结肠炎大鼠溃疡组织中NF-κB p65及IL-10表达的影响

马春花 罗京艺 朱东华 荆淑娟 尚毅

肠易安汤对溃疡性结肠炎大鼠溃疡组织中NF-κB p65及IL-10表达的影响

马春花 罗京艺 朱东华 荆淑娟 尚毅

目的 观察中药方“肠易安汤”对实验性大鼠溃疡性结肠炎结肠粘膜组织NF-κB p65、白细胞介素-10（IL-10）表达的影响。方法 采用2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）加免疫诱导法复制UC大鼠模型，39只大鼠，随机分组为模型组，肠易安汤组，柳氮磺胺吡啶（SASP）组。治疗21 d后观察大鼠结肠组织黏膜的病理改变（CMDI）、NF-κB p65、IL-10表达水平的变化。结果 治疗21 d后，肠易安汤组大鼠CMDI评分和NF-κB p65表达明显低于模型组（t=58.28，P=0.003；t=6.01，P=0.016）和SASP组（t=-22.10，P=0.026；t=-2.80，P=0.038），肠易安汤组IL-10表达明显高于模型组和SASP组（t=-403.56，P=0.022；t=35.76，P=0.036）。结论 肠易安汤对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织黏膜有良好的修复作用，其作用机理可能与降低NF-κB p65表达和提高IL-I0水平有关。

结肠炎，溃疡性； 白介素-10； 核因子κB p65； 肠易安汤

溃疡性结肠炎（ulcerativ olitis，UC）是一种慢性非特异性炎症性肠病，主要累及直肠、结肠黏膜，以腹痛、腹泻、黏液血便及里急后重为主要临床表现，病程迁延不愈，长达十几年甚至几十年，并存在着高于正常人群5～8倍的癌变率。该病发病率在欧美国家约为5～12/10万，在我国发病率呈逐年上升趋势，且癌变率在2～5%［1］。该病发病机制尚不明确，目前认为与机体免疫调节和炎性细胞因子等密切相关［2］。研究发现［3］溃疡性结肠炎发病与促炎因子和抗炎因子平衡失调关系密切。有关研究发现NF-κB p65及其介导的炎症通路在UC发生发展中发挥着重要作用［4］。而IL-10可以抑制其他相关细胞因子的分泌、迁移。西药治疗UC远期疗效较差，且容易产生药物依赖及毒副作用［5］。本研究主要观察中药方肠易安汤对UC大鼠症状、大鼠溃疡组织中IL-10、NF-κB p65表达水平的影响，从而探讨肠易安汤治疗UC的作用机制。

资料与方法

一、一般资料

（一）实验动物

50只Wistar健康大鼠，4～6周龄，雌雄各半，体重（200±30）g，购自南京医科大学实验动物中心。

（二）模型制备

参考段征等［6］的2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-TNBS）诱导联合免疫复合法。用4只大鼠结肠黏膜制成组织匀浆，以10000 r/min速度离心5～10分钟，提取上清液提纯，用考马斯蓝染色法检测蛋白质含量（浓度为16 mg/ml），与等量完全佛式佐剂配成抗原乳化液备用。39只大鼠在禁食24小时后开始造模。用100 mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉，将直径2 mm，长15 cm的硅胶管轻轻插入肛门8 cm，注入100 mg 0.5% TNBS/kg＋50%乙醇0.65 ml，14天后在大鼠腹股沟、足跖处注射抗原乳化液（含抗原8 mg）2次。造模后，随机选取2只模型大鼠处死，截取部分结肠组织，用10%中性福尔马林固定，以作病理检测（造模及灌胃过程中死亡5只大鼠），验证模型制备成功后将大鼠随机分为模型组、肠易安汤组及柳氮磺吡啶组各13只大鼠。

（三）主要试剂与仪器

浓度为5%的2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-TNBS）（试剂编号：P22970，美国Sigma公司产品）；弗氏完全佐剂（试剂编号：F5506，美国Sigma公司产品）；0.1%盐酸氯胺酮44 mL（产品批号：100817，福建古田药业有限公司产品）；匀浆机（型号：985-370）。

IL-10抗体IgG rabbit（产品编号：BA1201，武汉博士德生物工程有限公司）；goat Anti-Mouse IgG（产品编号：HRP-10004302，美国Jackson公司产品）；goat Anti-Rabbit IgC（产品编号：SC-2004，美国Jackson公司产品）；NF-κB p65磷酸化检测试剂盒（批号：20130125，北京中杉金桥生物技术有限公司）；免疫组化试剂盒（晶美生物工程有限公司生产，批号：DEC 022005）；BH2系统显微镜（日本Olympus公司产品）；I Leica QWin图像分析软件（上海申腾信息技术有限公司）；摄像机（PANASONIC公司，型号：MV-CP410）；切片机（德国徕卡公司产品 型号：RM2145）。

（四）实验药物

肠易安汤：党参30 g，黄芪45 g，白术15 g，山药15 g，薏苡仁15 g，芡实15 g，马齿苋15 g，紫草9 g，川芎9 g，将肠易安汤方中药物水煎高浓度梯度（75%、95%）乙醇提纯有效成分，制成使其含生药浓度为3.75 g/mL中药制剂；柳氮磺吡啶（SASP）制剂：将SASP药片碾成细末，溶于蒸馏水中制备悬浊液，使其含SASP浓度为0.093 g/mL。

二、实验方法

（一）给药方法

模型复制成功后第1天开始给药，连续给药21天。（二）标本采集

在给药第2l天将大鼠用脱颈椎法处死，解剖腹腔，取下距肛门约6～8 cm处长度3～5 cm的结肠组织，并对大鼠结肠组织进行CMDI（colon macroscopi amag ndex）评分，用冰生理盐水反复冲洗后，置于10%甲醛中保存备用。CMDI评分标准见表1。

表1 CMDI评分标准（分）

（三）检测指标及方法

1.免疫组化实验操作

采用免疫组化PAP二步法：将组织切片脱蜡反复洗涤后，用Ph 6.0的CB柠檬三钠缓冲液热诱导修复抗原。室温下，20%正常羊血清室温孵育后，滴加上述抗体，次日加羊抗免IgG-HRP（羊抗小鼠IgG-HRP）。洗涤后用DAB～H2O2底物显色，苏木素液复染。每个步骤间用0．01 MPBS反复洗涤2～3次。

2.NF-κB p65表达结果判断

免疫组织化学法检测结果显示，正常大鼠结肠织仅可见少量阳性细胞，且染色浅淡；UC大鼠结肠组织可见大量NF-κB p65阳性细胞，主要为核着色或胞质着色。

3.免疫组化阳性着色定量分析

染色结果应用LeicaQWin图象分析软件在250倍显微镜下，随机选取3个视野，计算区域的阳性面积（μm2），求出3个视野平均值。

三、统计学分析

实验结果采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，三组计量资料均进行方差齐性检验，均服从正态分布，计量资料采用均数±标准差（±s）方式表达，三组计量资料组间两两比较均采用单因素方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

结 果

三组UC大鼠CMDI评分、NF-κB p65、IL-10表达的数据列示于表2，整体比较（单因素方差分析）知：3组间整体比较均有显著性统计学差异（P＜0.05），肠易安汤组、SASP组与模型组比较差异均具有统计学意义（t=58.28，P=0.003；t=-38.11，P=0.002），肠易安汤组与SASP组比较具有统计学差异（t=-22.10，P=0.026），与模型组相比，肠易安汤组、SASP组大鼠结肠组织NF-κB p65表达量明显降低，差异有统计学意义（t=6.01，P=0.016；t=-1.27，P=0.008），肠易安汤组与SASP组比较明显降低，差异具有统计学差异（t=-2.80，P=0.038）。与模型组比较，肠易安汤组、SASP组IL-10水平明显升高，差异具有统计学意义（t=-403.56，P=0.022；t=41.70，P=0.018），肠易安汤组与SASP组比较，IL-10水平明显升高，差异具有统计学意义（t=35.76，P=0.036）。

表2 三组UC大鼠CMDI评分、NF-κB p65、IL-10表达的比较（s）

表2 三组UC大鼠CMDI评分、NF-κB p65、IL-10表达的比较（s）

组别例数CMDI评分NF-κB p65表达IL-10表达肠易安汤组130.88±0.120.17±0.38*73744.49±348.88*模型组133.60±0.120.40±0.1334673.11±11.65 SASP组131.86±0.110.32±0.19*55529.49±1803.25*整体比较：F/P7.63，＜0.0015.28，＜0.00134.28，＜0.001多重比较：LSD—t/P肠易安汤组vs模型组58.28，0.0036.01，0.016-403.56，0.022肠易安汤组vs SASP组-22.10，0.026-2.80，0.03835.76，0.036模型组vs SASP组 -38.11，0.002-1.27，0.00841.70，0.018

讨 论

目前，溃疡性结肠炎的发病机制尚不完全明确，大多数学者认为免疫反应异常是造成UC发病的重要因素，而相关细胞因子失衡在这个免疫调节和炎症过程中充当重要角色［7］。参与早期免疫反应和各阶段炎症反应的许多分子都受NF-κB 通路的调控，通过抑制肠组织NF-κB的活性、减轻UC炎症反应，可能是中西医药物治疗UC的重要机制之一［8-9］。NF-κB家族由5个成员构成，包括NF-κB1（p50/p105），NF-κB2（p52/p100），p65（ReIA），ReIB及C-Rel等，其中p65（ReIA）具有显著的促炎活性［10］。NF-κB在核内与κB序列结合促进多种炎性细胞因子如IL-1β，IL-2，IL-6，IL-8，TNF-α及TNF-β等的基因转录，所以NF-κB活化可能是UC发生发展的关键点［11］。有研究发现［12］NF-κB在UC大鼠结肠中表达明显升高，还有研究发现［13-14］NF-κB在UC患者结肠黏膜中处较高的表达水平，参与了UC的发生发展过程，检测其变化对疾病活动度的评价具有重要的临床意义。张夏梦等［15］研究显示清热燥湿凉血方能促进UC大鼠结肠组织上皮修复和结肠微血管生成，抑制结肠组织NF-κB的表达。实验结果显示，肠易安汤能够抑制UC大鼠模型过度表达NF-κB p65，控制炎症反应，减轻肠道损伤。

IL-10为细胞因子合成抑制因子，对激活的单核细胞、巨噬细胞、粒细胞及T细胞等有抑制作用，可下调IL-2、IL-3、γ干扰素等促炎因子水平，具有广泛的免疫抑制活性。实验发现［16］补充IL-10能够减缓UC的发生与发展，表明IL-10对调节肠道黏膜免疫系统的平衡，保护肠黏膜具有重要作用。而剔除大鼠IL-10基因（IL-10-/-）能诱发大鼠结肠炎［17］。其他研究结果也显示［18］，健脾中药能有效对抗UC模型大鼠IL-10的降低。

本研究表明，肠易安汤能有效降低大鼠结肠组织CMDI评分，同时降低NF-κB的表达水平，增加IL-10表达水平，表明肠易安汤可调节UC大鼠促炎因子NF-κB p65与抗炎因子IL-10的平衡，从而抑制大鼠UC的炎性反应。因此，免疫调节可能是肠易安汤有效促进UC结肠黏膜修复的作用机制之一，但其更深入的作用机制有待于进一步的研究。

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Effect of Changyian on the expression of nuclear factor kappa B and interleukin-10 in ulcerative colitis rats

Ma Chunhua, Luo Jingyi, Zhu Donghua, Jing Shujuan, Shang Yi.
Department of Anorectal Surgery, Liaocheng Second People′s Hospital, Shandong 252600, China

Ma Chunhua, Email: mahuaqinghe@163.com

Objective T bserv h ffec f Changyia h xpressio f NF-κB p65 and interleukin-10 i lcerativ oliti ats. Methods Ulcerativ oliti a ode a opie y 2, 4, 6-TNBS. Thirty-nin at er andoml ivide nto 3 groups：mode roup, Changyia rou n alazosulfapyridine (SASP) group. After 21 days′ treatment, th hange oloni ucosa amag ndex (CMDI) , level f NF-κB p65 and IL-10 wer bserved. Results After 21 days′ treatment, the CMDI an h xpressio f NF-κB p65 of Changyia rou a ignif i cantl owe ha h ode roup (t=58.28, P=0.003; t=6.01, P=0.016) and SASP group (t=-22.10, P=0.026; t=-2.80, P=0.038) . Th xpressio nterleukin-10 wa bviously highe ha ha ode rou nd SASP group (t=-403.56, P=0.022; t=35.76, P=0.036) . Conclusion Changyia a oo epai ffec lcerativ oliti at olo ucosa. It echanis a elate o reduc h xpressio f NF-κB p65an mprov h eve f IL-I0.

Colitis, ulcerative; IL-I0; Nuclea acto appa B p65; Changyian

2016-09-22）

（本文编辑：杨明）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2017.02.007

252600 山东省聊城市第二人民医院肛肠科

马春花，Email：mahuaqinghe@163.com