三种染色法对果蝇唾腺染色体制片优化设计

倪 奎

(安徽新闻出版职业技术学院 新闻传播系，合肥 230601)

三种染色法对果蝇唾腺染色体制片优化设计

倪 奎

(安徽新闻出版职业技术学院 新闻传播系，合肥 230601)

采用果蝇三龄幼虫为试验材料，经过剥离唾腺、解离、漂洗、染色、压片处理后，通过显微镜观察染色结果。染色步骤中，使用卡宝品红染色法、孚尔根染色法及孔雀绿染色法三种染色方法对照醋酸洋红染色法设定四组试验。试验结果表明卡宝品红染色法、孚尔根染色法及孔雀绿染色法的染色效果比醋酸洋红染色法的染色效果均有所提升。综合考虑染色时间、实验操作、染色液的配置及染色效果四个方面，孔雀绿染色法染色时间少、实验操作简便、染色液配置简单、染色效果好，使用孔雀绿染色法效率最高，可用于教学实验中。

黑腹果蝇;唾腺染色体制片;孔雀绿染色法;卡宝品红染色法;孚尔根染色法

果蝇唾腺染色体是研究染色体结构畸变, 基因定位及基因表达(mRNA合成) 的良好材料。高等学校在教学试验中一般把果蝇唾腺染色体制片实验列为遗传学实验的一个内容，传统实验采用的是醋酸洋红染色法，但其染色效果不佳，在教学试验中不利于学生的辨认。本试验采用卡宝品红染色法、孚尔根染色法及孔雀绿染色法三种染色方法对照醋酸洋红染色法对其进行探究改进。

近些年来，很多学者都在该实验的优化上做出一定的贡献，在实验材料选取、实验过程中解离、染色及压片几个方面进行了改进。早在1987年美国学者M. Ashburner在他的著作中对果蝇进行了详细的介绍，且将书中内容更新后于2005年发行了第二版。[1]在实验材料三龄幼虫的培养上，西北农林科技大学遗传工程实验室培养出了个体肥大、身体强壮、生命力旺盛的三龄幼虫，其唾液腺发达，腺体细胞核大且染色体着色快。[2]在剥离唾腺操作上，吉首大学的张贤阴提出利用幼虫自身的回缩力，可巧妙地将唾腺取出。[3]在剔除染色体上的脂肪与解离两个步骤上，1990年就有学者提出将上述两个步骤先后顺序互换，先解离，通过在唾腺上滴加一滴1mol/L盐酸处理3分钟后，再将脂肪剔除，这样不仅可以更简单地将脂肪剔除也利于细胞分离和染色体伸展。[4]而在染色这一方面，很多学者进行了探索，利用苯酚品红染液代替醋酸洋红染液，苏州大学潘新法、徐庆宏使用不同浓度的苯酚品红染液进行染色，对比发现浓度为8%至12%时染色效果最佳，[5]周口师范学院赵锦慧、刘中华使用改良苯酚品红染液发现染液浓度为6%，染色5到8分钟效果最佳[6]。但要达到较好的染色效果，配置好染液后需放置两周左右再使用。另有学者采用孚尔根染色法，较传统方法取得了更好的效果，且有学者对其进行了改进完善。[7]在压片方面，实验教材指导用手指用力下压，使染色体展开[8]，然而对于学生不易掌握下压力度。陕西师范大学王华峰、那冬晨提出采用解剖针敲击盖玻片，敲击的力度比较容易掌握，且染色体容易分散展开。[9]

1 试验内容

本试验主要针对果蝇唾腺染色体制片实验中染色及后续步骤操作进行探索改进。在染色操作中，采用卡宝品红染色法、孚尔根染色法及孔雀绿染色法三种染色方法对照醋酸洋红染色法对果蝇唾腺染色体进行染色，染色完成后进行压片，通过在显微镜检查染色效果。具体试验的技术路线见图1。

图1 果蝇唾腺染色体制片与观察

2 材料与方法

2.1 试验材料、试剂和器材 黑腹果蝇的三龄幼虫、卡宝品红染色液、席夫试剂、孔雀绿染色液、醋酸洋红染色液、生理盐水、1 mol/L盐酸、30%，45%浓度的醋酸溶液、显微镜、载玻片、盖玻片、解剖针、小烧杯、吸水纸等。

2.2 试验方法 果蝇三龄幼虫唾腺的剥离：取果蝇三龄幼虫置于载玻片上，滴一滴生理盐水，左手持解剖针按在虫体后1/3处，右手持解剖针按在头部黑点状口器的后侧，撕下头部并带出唾腺[10]。由于后面的实验操作因染色方法不同具体操作亦不相同，故以下将分别列出不同染色方法的实验具体操作。

2.2.1 醋酸洋红染色法

(1)将取出的唾腺置于载玻片上，滴加一滴1mol/L盐酸，解离2～3 min，将脂肪剔除;

(2)将唾腺转移到干净的载玻片上，滴加醋酸洋红染色液，固定染色10min；

(3)盖上盖玻片，用滤纸先轻轻压一下，吸去多余染液，置于实验台上，用解剖针在盖玻片上轻轻敲打，使唾腺染色体充分展开；

(4)将制作好的装片置于显微镜下观察。

2.2.2 卡宝品红染色法

(1)将取出的唾腺放在干净的载玻片中央, 加一滴1 mol/L的盐酸,解离3～5min，将脂肪剔除;

(2)用滤纸将盐酸溶液吸干, 滴加一滴蒸馏水, 一分钟后再将水分吸干, 漂洗3～4次;

(3)滴加1～2滴卡宝品红染色液于漂洗好的腺体上;

(4)染色时间设定为3、4、5、6、7min五个梯度，另外再将一组染色时间设定为10min；

(5)染色完成后盖上盖玻片，固定好盖玻片，用解剖针轻轻敲打，使染色体充分展开；

(6)在显微镜下检查制片效果。

2.2.3 孚尔根染色法

(1)取一小烧杯，向烧杯内倒入一定量1mol/L盐酸，将其置于恒温水浴锅中，温度保持在60℃，另取一小烧杯盛席夫试剂；

(2)将唾腺转移至盛盐酸的小烧杯中，20～30s；

(3)将唾腺取出，并将脂肪剔除，用蒸馏水冲洗3次；

(4)将唾腺转移至盛席夫试剂的小烧杯中，染色20min以上[11]；

(5)取出唾腺，水洗一次；

(6)将唾腺转移至一干净的载玻片，滴加一滴45%醋酸，盖上盖玻片，用解剖针轻轻敲打，使染色体充分展开；

(7)在显微镜下检查制片结果。

2.2.4 孔雀绿染色法

(1)将取出的唾腺放在干净的载玻片中央, 加1滴1mol/L的盐酸,解离3～5min，将脂肪剔除;

(2)用滤纸将盐酸溶液吸干, 滴加一滴蒸馏水, 1min后再将水分吸干, 漂洗3～4次;

(3)滴加1～2滴孔雀绿染色液于漂洗好的腺体上;

(4)染色时间设定为3、4、5、6、7min五个梯度，另外再添加一组染色时间设定为10min;

(5)染色完成后将唾腺染色体转移至另一载玻片上，滴加30%的醋酸，盖上盖玻片，固定好盖玻片用解剖针轻轻敲打，使染色体充分展开;

(6)在显微镜下检查制片效果。

3 结果与分析

通过显微镜下检查制片结果，选取最好的照片作为本实验的结果，见图2-5。

图2 卡宝品红染色法制片

图3 孚尔根染色法制片

图4 孔雀绿染色法制片

图5 醋酸洋红染色法制片

3.1 卡宝品红染色法制片结果分析

卡宝品红染色法与醋酸洋红染色法相比较染色简便快速，分色清晰。染色体呈紫红色，细胞质无色或有极淡的红色，染色效果有较大程度提升。采用滴染和浸染均可。用此法制得的染色体具有耐保存、高稳定、持久不褪色的优点。实验发现染色5、6、7、10min后效果无明显差距，且好于染色3、4min，故采用卡宝品红染色法时染色5min即可。染色液放置时间越长，染色效果越好，通常染液可在常温下存放两年而保持稳定不变质。

缺点：其染色效果与盐酸的解离过程密切相关。若解离时间太短, 细胞质会不同程度的着色，导致观察时染色体不够突出；当解离过度时， 染色体不易着色，背景也不会着色，可能观察不到染色体。只有在合适的解离条件下染色体着色紫红，细胞质无色或有极淡的红色。因此用此两种方法实验染色，需要把握时间的精确度高，通过实验发现盐酸解离的时间在3min左右各种效果最佳。

3.2 孚尔根染色法制片结果分析

孚尔根染色法染色时通常只对细胞核和染色体作用，使细胞核和染色体着色，而不对细胞质作用。染色体着色均匀，且可与其背景形成较大的反差，使染色效果有较大提升且易于观察。

缺点：(1)染色过程耗时长，需要20min以上。由于染色时间长，席夫试剂中所含的盐酸会使染色体过度软化，在压片时需要注意解剖针敲击的力度，谨慎操作，若操作不当可能会破坏染色体。 (2)水解条件比较苛刻，温度要严格控制在60℃左右，波幅不可超过±2℃。温度过高或时间过长会造成水解浓度、糖和醛基间的键破坏过大，醛基流失到水解液中，会使染色体着色不均匀或染色过深，细胞质也会着色或者出现大小不等的红色小粒；反之，染色体着色不够深，且细胞质中可能有其他醛基存在，而呈现扩散的颜色，会导致无法清晰观察染色体。只有水解合适，才能使染色体着色较深，而细胞质浅着色或不显示任何颜色，达到良好的染色效果。孚尔根染色法实验过程过于复杂，因教学试验中，学生需要实验的时间较长，不利于学生快速的看到实验结果，但是比较适合显微摄影，拍摄染色效果很好。

3.3 孔雀绿染色法制片结果分析

孔雀绿染色法与醋酸洋红染色法相比较，染色颜色深，分色清晰，染色效果有较大提升。也更容易染色，且染色简便快速。实验结果表明，使用孔雀绿染液染色5min效果较染色3、4min效果好，与染色6、7、10min效果无明显差别，故采用孔雀绿染色法时染色5min即可。

4 讨 论

4.1 三种染色方法染色时间比较

卡宝品红染色法与孔雀绿染色法染色时间只需要5min左右即有很好的染色效果，较醋酸洋红染色法染色耗时少；孚尔根染色法需要至少20min，耗时最长。在教学实验中，可方便使用卡宝品红染色法与孔雀绿染色法染色此两种方法，时间较短，以便于学生很快看到实验效果，而孚尔根染色法染色时间较长，不利于课堂实验。

4.2 三种染色方法实验操作比较

卡宝品红染色法与醋酸洋红染色法相比操作步骤相似；孚尔根染色法操作较醋酸洋红染色法繁琐且实验过程中需要控制好实验条件；孔雀绿染色法操作步骤与醋酸洋红染色法相似，但是孔雀绿染液易挥发, 所以在染色过程中需要适时滴加染液。故从操作步骤上来说，卡宝品红染色法最为简单易操作，而孚尔根染色法步骤最为繁琐。

4.3 三种染色方法染色液的配置比较

卡宝品红染色液: 称3 g碱性品红溶于100 mL70%酒精中得到原液A；取10 mL原液A, 加入到90 mL5%苯酚水溶液中得到原液B；再取55 mL原液B,加其中入6mL冰醋酸和6 mL甲醛得到原液C；最后取20 mL原液C,加入80 mL45%的醋酸和1 gD-山梨醇即制成卡宝品红染色液。

席夫试剂: 称取0.5 g碱性品红, 加到100 mL已煮沸的蒸馏水中溶解, 待溶液冷却到50℃时, 将其过滤到一棕色试剂瓶中,等溶液冷却至25℃时,加入10 mL，1 mol/L盐酸和1 g偏重亚硫酸钠, 置于黑暗处, 静置18h后溶液呈草黄色即可使用。[9]

孔雀绿染色液: 称取1 g孔雀绿溶于19 mL水中,然后加入80 mL纯酒精、1 mL冰醋酸, 过滤后即可使用。

卡宝品红染色液配置需要原材料多，配置过程繁琐，耗时稍多；席夫试剂配置所需原材料少，配置过程较繁琐且耗时很长；孔雀绿染液配置所需原材料少，配置过程简单，耗时较少。

4.4 三种染色方法染色效果比较

卡宝品红染色法、孚尔根染色法、孔雀绿染色法染色效果都好于醋酸洋红染色法染色效果。其中卡宝品红染色法和孔雀绿染色法染色效果相当，孚尔根染色法染色效果最佳(见表1)。

表1 卡宝品红染色法、孚尔根染色法、孔雀绿染色法比较分析

5 结 论

综合考虑染色时间、实验操作、染色液的配置及染色效果四个方面，孔雀绿染色法染色时间少、实验操作简便、染色液配置简单、染色效果好，孔雀绿染色法效率最高。在教学实验中，以便于学生在试验中很快得到实验结果。但孚尔根染色法实验时间校长，步骤繁琐，但实验得出的效果最佳，染色界面清晰，在商业制片中可用此种方法。

[1] Ashburner M,Golic Kent ,Hawley R.Scott .Drosophila:A Laboratory Handbook[M].2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,2005:1- 81.

[2] 胡甘.用于果蝇唾腺染色体实验材料的培养方法[J].实验科学与技术,2007(5):38- 39.

[3] 张贤阴.果蝇唾腺染色体制片的小技巧[J].生物学通报,2004,39(4):61.

[4] 许祖国.果蝇唾腺染色体实验的改进[J].生物学杂志，1990(2):44- 45.

[5] 番新法,许庆宏.不同浓度的苯酚品红对果蝇唾腺染色体的染色效果[J].生物学杂志,2002,19(5):26- 27.

[6] 赵锦慧,刘中华.改良苯酚品红染液对果蝇唾腺染色体制片效果的影响[J].生物学教学, 2011, 36 (4): 41- 42.

[7] 刘丽影,刘文静,邵红.果蝇唾腺染色体四种染色方法的比较[J].佳木斯大学学报(自然科学版)，2007,25(3):424- 426.

[8] 刘祖洞,江绍慧.遗传学实验[M].2版.北京:高等教育出版社,1987:9- 13.

[9] 王华峰,那冬晨.果蝇唾腺染色体观察实验教学的改革与探索[J].实验室科学,2009(5):69- 70.

[10] 郭善利,刘林德.遗传学实验教程[M].北京:科学出版社,2004:25- 28.

[11] 薛小桥,金珊.用Feuglen染色法制做果蝇唾腺染色体[J].生物学通报,2002(2):23.

[责任编辑：张永军]

Improved Design of the Slide Making of Drosophila Salivary Gland Chromosome Based on three Staining Methods

NI Kui

(Journalism and Communication, Anhui News and Publishing Vocational College, Hefei 230601，China)

Adopting the third instar larvae ofDrosophilamelanogasteras test material，this test obtained the dyeing results by observing microscopic after stripping salivary glands, dissociation, rinsing, dyeing and tableting process. In the process of dyeing, four groups of test were designed by comparing the carbol fuchsin dyeing, Feulgen dyeing and malachite green dyeing method with the carmine staining dyeing. The results show that the carbol fuchsin dyeing, Feulgen dyeing and malachite green dyeing have been more effective than that of the carmine staining dyeing. Taken into the overall consideration of dyeing time, experimental operation, preparation of the dyeing and dyeing effects, the malachite green dyeing has the best efficiency with less time, simpler experimental operation and preparation of dyeing and better dyeing effects, which can be applied in teaching experiments.

Drosophilamelanogaster;salivary gland chromosome preparation;malachite green dyeing;carbol fuchsin dyeing;Feulgen dyei

2016-11-28

2017-02-23

2015年高校人文社科重点项目“基于景观生态学的高校校园规划研究”(SK2015A688)资助。

倪 奎(1980— )，男，安徽桐城人，安徽新闻出版职业技术学院新闻传播系讲师。

Q343.21

A

2096-2371(2017)02-0079-05