食用植物油中4种氯丙醇脂肪酸酯的GC-MS测定方法研究

柏文良，杜业刚，陈 萌，张浩英，李碧芳

(深圳市计量质量检测研究院，广东 深圳 518109)

油脂安全

食用植物油中4种氯丙醇脂肪酸酯的GC-MS测定方法研究

柏文良，杜业刚，陈 萌，张浩英，李碧芳

(深圳市计量质量检测研究院，广东 深圳 518109)

采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术，建立了同时测定食用植物油中3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯(3-MCPD酯)、2-氯-1,3-丙二醇脂肪酸酯(2-MCPD酯)、1,3-二氯-2-丙二醇脂肪酸酯(1,3-DCP酯)和2,3-二氯-1-丙二醇脂肪酸酯(2,3-DCP酯)含量的分析方法。该方法在0.005～0.5 mg/L范围内线性关系良好，检出限0.1 mg/kg，定量限0.2 mg/kg，加标回收率在97.2%～106.0%之间，相对标准偏差在3.4%～7.1%之间。该方法操作简便，灵敏度高，重复性好，定性定量准确，对仪器污染小，能满足食用植物油中氯丙醇酯的检测需求。

食用植物油；3-MCPD酯；2-MCPD酯；1,3-DCP酯；2,3-DCP酯；GC-MS

氯丙醇脂肪酸酯(简称氯丙醇酯)是近年来国际上新发现的一类食品污染物，包括3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯(3-MCPD酯)、2-氯-1,3-丙二醇脂肪酸酯(2-MCPD酯)、1,3-二氯-2-丙二醇脂肪酸酯(1,3-DCP酯)和2，3-二氯-1-丙二醇脂肪酸酯(2,3-DCP酯)。氯丙醇酯的健康风险主要是基于其在体内水解为氯丙醇的假设[1]。目前已知3-氯-1，2-丙二醇(3-MCPD)具有遗传毒性和肾脏毒性，是可能的致癌物，1,3-二氯-2-丙二醇(1,3-DCP)和2,3-二氯-1-丙醇(2,3-DCP)为遗传毒性致癌物，会引起小鼠肝脏和肾脏的损伤[2]，其中以3-MCPD在食品中污染量最大，毒性最强，因此常作为氯丙醇类化合物的代表和毒性参照物。据文献报道，在绝大部分食用植物油中均存在氯丙醇酯，其中尤以棕榈油、芝麻油、菜籽油、棉籽油等食用植物油中氯丙醇酯的污染问题较突出，油脂精炼各工序中均可能形成3-MCPD酯，但关键在脱臭工序，高温加快了3-MCPD酯的生成反应，几乎所有3-MCPD 酯是在脱臭这一步形成的，其原因可能是油脂在精炼脱臭工序中脱臭温度较高，加快了氯丙醇酯的生成反应[3-4]。

关于食用植物油中氯丙醇酯的检测方面，国外已有一些研究，国内还较少，且大多局限于3-MCPD酯。目前食用植物油中氯丙醇酯的检测有直接法和间接法两种[5-6]。直接法不破坏氯丙醇酯的分子结构，采用液相色谱-质谱法(LC-MS)直接检测其含量[7-8]；间接法将食用植物油中氯丙醇酯转化为游离态的氯丙醇，通过气相色谱-质谱法(GC-MS)测定游离氯丙醇的含量[9-11]。受仪器和标准品等限制，目前国际上多采用间接法测定植物油中的氯丙醇酯。本研究采用间接法，将样品中的氯丙醇酯先经甲醇钠甲醇水解为氯丙醇，再以硅藻土固相萃取柱净化，经七氟丁酰基咪唑衍生化后采用GC-MS检测，同位素内标法定量，建立了能够简单快速地同时检测植物油中4种氯丙醇酯(3-MCPD酯、2-MCPD酯、1,3-DCP酯和2,3-DCP酯)的GC-MS。同时利用该方法对不同种类的食用植物油中的4种氯丙醇酯进行了检测，验证了方法的可行性，也为食用植物油中氯丙醇酯变化规律的研究提供一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

3-MCPD(纯度98%)、d5-3-MCPD(纯度97%)，购自美国Aldrich公司；1,3-DCP(纯度98%)、2,3-DCP(纯度98%)、d5-1,3-DCP(纯度98%)、d5-2,3-DCP(纯度98%)，购自加拿大CDN公司；2-MCPD(纯度98%)、d5-2-MCPD(纯度98%)、3-MCPD棕榈酸二酯(纯度98%)、d5-3-MCPD棕榈酸二酯(纯度99%)、2-MCPD硬脂酸二酯(纯度98%)、d5-2-MCPD硬脂酸二酯(纯度99%)，购自加拿大TRC公司；由于国际上暂无1,3-DCP酯、2,3-DCP酯及其内标售卖，因此内标用d5-1,3-DCP、d5-2,3-DCP代替d5-1,3-DCP酯、d5-2,3-DCP酯，加标试验用1,3-DCP、2,3-DCP代替1,3-DCP酯、2,3-DCP酯。

正己烷、乙酸乙酯、甲醇、冰乙酸，均为色谱纯，购自德国Merck KGaA公司；叔丁基甲基醚，色谱纯，购自西班牙Scharlau Chemie S.A公司；甲醇钠(0.5 mol/L)，购自美国Sigma公司；无水硫酸钠，优级纯，200℃烘烤4 h后使用；氯化钠，分析纯；七氟丁酰基咪唑(HFBI，纯度>97%)，购自日本TCI公司。

硅藻土固相萃取柱(Chem ElutTM，3 mL)，购自德国Merck KGaA公司。

特级初榨橄榄油、大豆油、花生油、芝麻油、茶籽油、菜籽油、棕榈油，购买于深圳市各市场。

Agilent 7890A-5975C气相色谱质谱联用仪，美国Agilent公司；2-16P型离心机，德国Sigma公司；Vortex Genius 3型涡旋仪，德国IKA公司；CPA2245型电子天平；DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱；Turbovap LV型浓缩氮吹仪，美国Biotage公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

标准储备液：分别准确称取10.0 mg的各氯丙醇、氯丙醇酯及其内标标准品于10 mL棕色容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，充分混匀得到质量浓度为1 000 μg/mL的单标储备液，于-20℃保存，有效期小于等于6个月。

标准工作液：取适量3-MCPD棕榈酸二酯、2-MCPD硬脂酸二酯、1,3-DCP、2,3-DCP标准储备液于同一容量瓶中，用正己烷稀释至刻度，得到质量浓度为10 μg/mL的混合标准工作液(3-MCPD棕榈酸二酯、2-MCPD硬脂酸二酯均以MCPD 计，下同)；按照同样方法，配制d5-3-MCPD棕榈酸二酯、d5-2-MCPD硬脂酸二酯、d5-1,3-DCP、d5-2, 3-DCP混合内标工作液，有效期小于等于2周。

同上，分别配制质量浓度为10 μg/mL的3-MCPD、2-MCPD、1,3-DCP、2,3-DCP混合标准工作液及d5-3-MCPD、d5-2-MCPD、d5-1,3-DCP、d5-2,3-DCP混合内标工作液，于-20℃保存，用于配制标准系列溶液。

1.2.2 样品的制备

水解：称取0.1 g食用植物油样品，准确加入20 μL上述混合内标工作液和0.5 mL甲基叔丁基醚-乙酸乙酯(体积比8∶2)，涡旋混匀。随后加入1 mL甲醇钠甲醇(0.5 mol/L)，涡旋混匀，室温静置4 min 后，迅速加入3 mL冰乙酸与饱和氯化钠混合溶液(体积比1∶29)和3 mL正己烷，涡旋混匀，静置分层后弃去上层有机相，水相待净化处理。

净化：将上述水相加至3 mL硅藻土固相萃取柱中，静置10 min，加入17 mL乙酸乙酯-正己烷(体积比6∶4)洗脱，用15 mL具塞带刻度玻璃管接收洗脱液，在低于40℃下氮吹至近干，加入1 mL异辛烷复溶，涡旋混匀，待衍生化。

衍生化：用0.5 mL气密针加入50 μL衍生试剂HFBI于1 mL异辛烷复溶液中，立即加盖密塞，涡旋混合后，于70℃保温20 min。取出后，放至室温，加饱和氯化钠溶液2 mL，涡旋混匀30 s，静置使两相分离。取上层有机相过滤至进样瓶中，待GC-MS 测定。

1.2.3 检测条件

GC条件：DB-5 ms色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度230℃；升温程序为初温50℃，保持1 min，以2℃/min升至78℃，再以40℃/min升至260℃，保持3 min；载气为氦气，流速1.0 mL/min；不分流进样，进样体积1 μL。

MS条件：电子轰击源(EI)，能量70 eV；传输线温度280℃；离子源温度250℃；溶剂延迟时间5 min；质谱采集时间5～12 min；采用选择离子监测(SIM)采集，监测的氯丙醇及其内标衍生物特征离子见表1。

表1 监测的氯丙醇及其内标衍生物特征离子

化合物保留时间/min定性离子(m/z)定量离子(m/z)1,3-DCP衍生物10.79677,275,27775d5-1,3-DCP衍生物10.59181,278,280792,3-DCP衍生物11.50677,111,25375d5-2,3-DCP衍生物11.31581,116,257793-MCPD衍生物14.437289,275,453253d5-3-MCPD衍生物14.242278,294,2962572-MCPD衍生物14.798289,291,75253d5-2-MCPD衍生物14.61879,294,296257

2 结果与讨论

2.1 样品制备条件的优化

水解步骤参考了卢跃鹏等[12]的试验条件，采用冰乙酸与100 g/L硫酸钠混合溶液(体积比1∶29)中和溶液的碱性，试验发现，使用饱和氯化钠溶液比使用硫酸钠溶液时的回收率要高。并考察了冰乙酸与饱和氯化钠溶液体积比为1∶29、2∶28和3∶27 3种比例的溶液，结果显示在体积比1∶29时回收率最高。

洗脱时，一般采用乙酸乙酯作为洗脱液。试验中发现在乙酸乙酯中添加一定比例的正己烷能使之更好地匹配氯丙醇的极性，以减少非目标物质的干扰。试验结果表明正己烷比例在50%以上时会严重影响回收率；在20%时的回收率最高，但随之洗脱下来的杂质也多，干扰检测结果；在40%时的回收率较为理想，且杂质较少，因此采用体积比为6∶4的乙酸乙酯-正己烷混合溶液作为洗脱液。

复溶时，卢跃鹏等[12]和里南等[13]使用的溶液是正己烷，但正己烷在接下来的衍生化步骤中，于70℃高温下极易挥发，导致定容体积不准，因此改用挥发性较弱的异辛烷进行复溶。

2.2 线性试验

准确移取适量1.2.1中的氯丙醇及混合内标工作液，以正己烷稀释氯丙醇质量浓度分别为0.005、0.01、0.02、0.1、0.5 μg/mL的标准系列溶液，内标质量浓度均为0.1 μg/mL。取各质量浓度标准系列溶液2 mL，低于40℃下氮吹至近干，用异辛烷定容至1 mL，涡旋混匀，按1.2.2进行衍生化后分别进样，测定4种氯丙醇及其内标相应的色谱峰面积。以标准溶液的各氯丙醇与相应内标的质量比(x)为横坐标，以峰面积(y)比为纵坐标，绘制标准曲线，4种氯丙醇的线性范围、线性方程及相关系数见表2。由表2可知，该方法在0.005～0.5 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数均在0.99以上。

表2 线性试验结果

2.3 方法检出限和定量限

以空白样品基质(特级初榨橄榄油)0.200、0.400、0.800、1.00、2.00 mg/kg 5个水平的3-MCPD棕榈酸二酯、2-MCPD硬脂酸二酯、1,3-DCP酯(以1,3-DCP代替)、2,3-DCP酯(以2,3-DCP代替)添加回收的响应为基础，以信噪比为3计算方法的检出限，以信噪比为10计算方法的定量限，结果见表3。由表3可知，该方法的4种MCPD酯检出限和定量限分别为0.1、0.2 mg/kg。

表3 食用植物油中氯丙醇酯的检出限和定量限

2.4 方法精密度和准确度

以空白特级初榨橄榄油为基质，分别在不同的浓度水平进行加标回收率试验，平行制备5个样品，以基质加标的回收率表示方法的准确度，以加标回收率的相对标准偏差(RSD)表示方法的精密度。结果见表4。

由表4可知，氯丙醇酯的各水平空白加标的回收率在97.2%～106.0%之间，相对标准偏差在3.4%～7.1%之间，说明方法的精密度和准确度良好。

表4 加标回收率试验(n=5)

2.5 样品检测

利用上述分析方法检测了6种市售食用植物油样品中3-MCPD酯、2-MCPD酯、1,3-DCP酯、2,3-DCP 酯的含量，每种样品做5个平行样，取平均值，结果见表5。

表5 食用植物油样品中氯丙醇酯的测定结果 mg/kg

样品3-MCPD酯2-MCPD酯1,3-DCP酯2,3-DCP酯大豆油0.5850.506--花生油1.4300.734--芝麻油1.3801.040--茶籽油1.3400.736--菜籽油1.6600.918--棕榈油4.2001.040--

由表5可知，6种食用植物油中均存在3-MCPD酯和2-MCPD酯的污染，1,3-DCP酯和2,3-DCP酯均未检出。3-MCPD酯含量和2-MCPD酯含量存在一定的相关性，3-MCPD酯含量高的样品中2-MCPD酯含量也较高。棕榈油受氯丙醇酯的污染最严重，大豆油受污染程度最轻，花生油、芝麻油、茶籽油和菜籽油受污染程度相当。造成食用植物油品种间氯丙醇酯污染水平差异的原因可能是不同油料所含氯丙醇酯的前体物质，如三酰基甘油酯、氯离子等含量存在差异以及精炼工艺的差异[14]。精炼时若采用磷酸脱胶，可能会增加体系中的氯离子含量，导致氯丙醇酯含量增加；脱色助剂的种类和酸性强弱也会影响油脂体系中的氯丙醇酯含量；精炼植物油氯丙醇酯主要产生于脱臭工序，脱臭温度越高，需通入的水蒸气就越多，氯丙醇酯含量也越高。

3 结 论

建立了同时测定食用植物油中3-MCPD酯、2-MCPD酯、1,3-DCP酯、2,3-DCP酯含量的GC-MS。该方法在0.005～0.5 mg/L范围内线性关系良好，检出限为0.1 mg/kg，定量限为0.2 mg/kg，加标回收率在97.2%～106.0%之间，相对标准偏差在3.4%～7.1%之间。本方法操作简单，灵敏度高，定性定量准确，重复性好，对仪器污染小，能够很好地满足食用植物油中氯丙醇酯的检测以及相关质监部门监管需要。

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Determination of four kinds of chloropropanols fatty acid esters in edible vegetable oil by GC-MS

BAI Wenliang, DU Yegang, CHEN Meng, ZHANG Haoying, LI Bifang

(Shenzhen Academy of Metrology & Quality Inspection, Shenzhen 518109,Guangdong, China)

A method for the simultaneous determination of the contents of 3-monochloropropane-1,2-diol (3-MCPD ester), 2-monochloropropane-1,3-diol (2-MCPD ester), 1,3-dichloropropane-2-ol (1, 3- DCP ester) and 2,3-dichloropropane-1-ol(2,3-DCP ester) in edible vegetable oil was established by gas chromatography-mass spectrography (GC-MS). The method showed good linear relationship in the range of 0.005-0.5 mg/L. The detection limit and quantification limit were 0.1 mg/kg and 0.2 mg/kg respectively. The recovery rate was between 97.2%- 106.0%, and the relative standard deviation was between 3.4%- 7.1%. The method was easily operated with good sensitivity, good repeatability, precise quanlification and quantification and little pollution to instrument, and it could meet the determination demand of chloropropanols fatty acid esters in edible vegetable oil.

edible vegetable oil; 3-MCPD ester; 2-MCPD ester; 1,3- DCP ester; 2,3-DCP ester; GC-MS

2016-05-21；

2016-11-16

柏文良(1984)，男，工程师，硕士，主要从事食品安全检测与研究工作(E-mail)reagee@qq.com。

李碧芳，高级工程师，硕士(E-mail)libf@smq.com.com。

TS225.1;TS201.6

A

1003-7969(2017)02-0081-05