重组Ⅱ型单纯疱疹病毒(OH2)基因组修饰稳定性研究*

孙美玲，邹建文，徐赐栋，吴基良，李炎坤**，刘滨磊

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.武汉滨会生物科技股份有限公司)



重组Ⅱ型单纯疱疹病毒(OH2)基因组修饰稳定性研究*

孙美玲1，邹建文1，徐赐栋1，吴基良1，李炎坤1**，刘滨磊2**

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.武汉滨会生物科技股份有限公司)

目的 探讨重组Ⅱ型单纯疱疹病毒(OH2)基因组修饰的稳定性。方法 型别鉴定实验根据I型(HSV-1)及II型(HSV-2)单纯疱疹病毒gD糖蛋白基因的保守序列设计引物进行PCR扩增，HSV-1 PCR片段上有一个MspI酶切位点，经酶切及电泳实验鉴别OH2病毒的型别；基因修饰实验根据被敲除或插入的序列位点上下游病毒核酸序列设计引物进行PCR扩增及电泳，并用电泳图分析OH2病毒基因组中是否剔除ICP34.5基因、ICP47基因及插入hGM-CSF基因；ELISA检测OH2上清中hGM-CSF含量验证插入的hGM-CSF基因能否正常表达。结果 型别鉴定实验中HSV-1经酶切实验出现130bp和70bp两条条带，而HSV-2和OH2病毒PCR条带和酶切条带均只有一条，且为200bp。基因修饰实验中OH2病毒在四对引物下扩增，能扩增出对应大小的条带。ELISA实验中hGM-CSF浓度在31.25～500pg/mL范围内线性关系良好，且OH2病毒中hGM-CSF表达量均大于2ng/mL。结论 OH2病毒中被修饰的基因稳定地存在，同时插入的hGM-CSF基因能够正常表达。

OH2病毒；型别鉴定；基因修饰；ELISA实验

近年来溶瘤病毒的研究得到迅速的发展，单纯疱疹病毒作为其中的一种溶瘤病毒已引起了学者们的极大关注。本研究团队主要致力于Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒(OH2)的研究。构建的OH2病毒敲除了神经毒力基因ICP34.5及免疫抑制基因ICP 47，并插入编码人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因[1-2]。OH2病毒感染肿瘤细胞时更易产生合胞体，即为病毒导致感染细胞及相邻细胞的融合现象，表现为若干细胞的相邻细胞膜消失，成为多核巨细胞[3]。合胞体可以诱导加强抗肿瘤免疫反应，在药效学试验中OH2病毒显示出良好的治疗效果。OH2为双链DNA病毒，其基因组虽然比RNA病毒基因组稳定，但也可能发生变异而影响OH2病毒的疗效及安全性。因此，必须对OH2病毒基因组的稳定性进行研究，以确保OH2病毒抗肿瘤疗效及降低危害人体的风险。

本课题研究目的主要验证改造后病毒基因组的稳定性及在保证基因修饰稳定存在的情况下，插入的hGM-CSF基因能否正产表达hGM-CSF。研究中涉及的实验包括病毒基因组DNA提取、PCR产物酶切鉴定单纯疱疹病毒的型别、PCR法鉴定OH2病毒基因修饰、细胞培养及ELISA检测hGM-CSF含量。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞系 Vero细胞来自正常的非洲绿猴肾上皮的细胞系，对脊髓灰质炎病毒、SV40、麻疹病毒等多种病毒易感，该细胞系对溶瘤病毒HSV也高度易感。细胞培养时推荐的传代比例为1∶4。培养条件为FGM(DMEM/F12培养基，含5%新生牛血清)，37℃恒温，5%CO2的孵箱进行培养。

1.1.2 病毒 Ⅰ型单纯疱疹病毒17+、Ⅱ型单纯疱疹病毒HG52及OH2病毒，均由本实验室保存。

1.1.3 试剂 DMEM/F12培养基(Hyclone)、新生牛血清(四季青)、50×TAE(Biosharp)、琼脂糖(Biowest)、DNA Marker(Generay Biotech)、DNAzol(Bioteke corporation)、上样5×buffer(Generay Biotech)、PCR Mix(Tran)、HSV gD基因上游引物FR1及下游引物FR2(天一致远公司合成)、MspI及对应buffer(BioLabs)、基因修饰引物序列(天一致远公司合成)、High GC DNA聚合酶(Invitrogen)、hGM-CSF MAb(Thermo)、hGM-CSF Ab-biotin(Thermo)、Streptavidin-HRP(Thermo)、hGM-CSF(厦门特宝生物工程有限公司)、TMB显色液(Beyotime)。

1.2 方法

1.2.1 病毒血清及DNA获得 培养Vero细胞，待其汇合度为100%，按MOI=0.1感染细胞。接种OH2病毒后24～48h，观察Vero细胞病变情况，当细胞完全病变，收获OH2病毒培养上清并于2300rpm离心5min，吸取上清液并分装至若干支EP管，将其放至-70℃低温冰箱中保存备用。

用DNAzol试剂提取病毒(OH2病毒及Ⅰ型单纯疱疹病毒17+、Ⅱ型单纯疱疹病毒HG52)DNA，提取过程严格按照Bioteke corporation试剂说明书进行。

1.2.2 型别鉴定实验 实验方法为本研究团队建立，因此在使用本方法之前按照药典中规定，依照定性研究的要求对各实验的各指标进行验证。

根据Ⅰ型及Ⅱ型单纯疱疹病毒的保守序列gD糖蛋白设计一对引物，HSV gD 上游引物FR1：5'-TGCTCCTACAACAAGTC-3'；HSV gD 下游引物FR2：5'-CGGTGCTCCAGGATAAA-3'。设置阴性对照组H2O及野生型对照组17+ DNA、HG52 DNA进行PCR反应。

PCR反应条件设置如下：94℃ 2min，(94℃ 30s，50℃ 10s，72℃ 10s)×30个循环。PCR产物经酶切、电泳后，凝胶成像，记录实验结果。

1.2.3 基因修饰实验 已按照定性实验的要求验证。

(1)根据被修饰的基因序列设计引物

表1 修饰基因及对应引物

(2)OH2 DNA、阴性对照(Vero DNA)及野生型对照(17+ DNA、HG52 DNA) 分别在四对引物条件下扩增，扩增条件如下：96℃ 2min，(96℃ 1min，50℃ 30s，72℃ 3min)×30个循环。PCR产物经酶切、电泳后，凝胶成像，记录实验结果。

1.2.4 ELISA检测hGM-CSF含量 ELISA实验检测hGM-CSF含量的方法为本实验室建立和验证。

采用夹心法，根据hGM-CSF的特性，选择符合要求的一抗hGM-CSF MAb及二抗hGM-CSF Ab-biotin。根据标准曲线求被测样品中hGM-CSF的含量,需设置标准品浓度，分别为500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL，同时设置阴性对照(样品稀释液)，空白对照未包被一抗加入500pg/mL标准品。所有实验步骤按自建的标准操作规程(SOP)进行。

最终用酶标仪检测样品及标准品的OD值，用标准品OD值绘制标准曲线，再用样品OD值参比标准曲线求得样品中hGM-CSF含量。

2 结 果

2.1 PCR产物酶切鉴定单纯疱疹病毒的型别实验 单纯疱疹病毒PCR产物电泳所得条带约出现200bp阳性条带。酶切判定：PCR产物用MspI酶切，出现约130bp和70bp两条带，则为Ⅰ型单纯庖疹病毒。不出现两条带则为Ⅱ型单纯疱疹病毒(Ⅰ型病毒片段序列nt131-134处有唯一MspI酶切位点CCGG，Ⅱ型病毒则没有)。

如图1(封三)所示，OH2病毒(泳道2和6)及Ⅱ型单纯疱疹病毒HG52(泳道4和8)可以与Ⅰ型单纯疱疹病毒(泳道3和7)区别开。

比较图1 P9代OH2病毒及图2(封三)P3代OH2病毒型别鉴定图谱结果，OH2病毒在传代过程中，基因型别未发生变化。

2.2 PCR法鉴定基因修饰实验 引物H2D3F和BGHPAR2扩增出的条带大小约为2.6kp，引物CMVF和H2D3R扩增出的条带大小约为1.8kp，提示剔除了ICP34.5及插入了hGM-CSF表达盒。

引物H2D4F和引物47DSR3扩增出的条带大小约为1.7kp，引物H2D4R和引物47USF1扩增出的条带大小约为1.3kp，即可证明基因ICP47已被剔除。

阴性对照Vero DNA扩增出的条带大小能够与OH2预期条带大小相区别或未出现条带。而野生Ⅰ型单纯疱疹病毒17+及野生Ⅱ型单纯疱疹病毒HG52扩增出条带大小与OH2预期条带大小不同。OH2病毒经四对引物扩增、电泳，出现条带的大小可以作为OH2基因修饰是否稳定存在的依据。

OH2病毒基因组中敲除了基因ICP34.5及ICP47，并插入hGM-CSF基因。比较图3(封三)P9代OH2病毒及图4(封三)P10代OH2病毒的基因修饰结果，OH2病毒在传代过程中修饰基因稳定存在。

2.3 ELISA检测hGM-CSF含量 以标准品浓度的log值为X轴，标准品OD值为Y轴，根据5个不同浓度标准品的OD值绘制出5个坐标点，然后依据这五个坐标点用Excel拟合出线性回归方程，取在线性范围内的待测样本OD值计算hGM-CSF的浓度，乘以稀释倍数即为上清中hGM-CSF的浓度。检测样品中hGM-CSF含量均大于2ng/mL，说明插入的hGM-CSF基因正常表达。

表2 被测样品中hGM-CSF含量

检测出P10代及P1代OH2病毒中hGM-CSF含量均大于2ng/mL。

以上实验表明，OH2病毒基因组被修饰基因稳定存在，并且插入的hGM-CSF基因能够正常表达。且在病毒传代过程中，修饰的基因稳定存在，hGM-CSF表达量稳定。

3 讨 论

肿瘤疾病严重威胁着人类的健康，而现有的治疗往往不尽如意，且有严重的副反应，因此寻找一种安全并且可靠的治疗方法成为肿瘤学界一直努力的目标。

近年来，利用单纯疱疹病毒的特性经基因重组后用于治疗肿瘤成为国内外研究的热点。重组单纯疱疹病毒的抗肿瘤效应表现在选择性地在肿瘤细胞内增殖，杀死肿瘤细胞的同时改变肿瘤生存的微环境，进而引发一连串的宿主抗肿瘤反应[4]。针对这一特点，有目的地改造单纯疱疹病毒的基因使其能够表达抗肿瘤蛋白并结合其他疗法加强抗肿瘤作用。有研究[5]发现，重组能表达血管抑制素的溶瘤单纯疱疹病毒结合贝伐单抗治疗肿瘤能够促进病毒在肿瘤组织的扩散及细胞的溶解，增加抑制血管内皮生长因子的血管抑素的表达和贝伐单抗诱导的入侵标记蛋白，有效地诱导机体抗肿瘤免疫反应。此外，重组单纯疱疹病毒还可与埃罗替尼等抗肿瘤药物联合治疗恶性周边鞘神经转移瘤，并在肿瘤治疗模型中能够抑制肿瘤生长及血管形成[6]。

本研究源于改造后的Ⅱ型单纯疱疹病毒基因组稳定性，Ⅱ型单纯疱疹病毒相较于RNA病毒比较稳定，但在改造过程中依然会发生基因组的变异。改造后的病毒基因组发生改变一般都会影响其生物活性，甚至用于人体后会引起严重不良反应。

本课题设计不同代次OH2病毒的型别鉴定、基因修饰及ELISA检测hGM-CSF表达量实验，实验结果表明修饰基因稳定存在，并能正常表达需要的蛋白，且传代过程不影响基因组的稳定性。

[1]LIU B L，ROBINSON M，HAN Z Q,et al.ICP34.5 deleted herpes simplex virus with enhanced oncolytic，immune stimulating，and antitumour properties[J].Gene Ther,2003,10(4):292

[2]RANDAZZO B P,BHAT M G,KESARI S,et al.Treatment of experimental subcutaneous human melanoma with a replication-restricted herpes simplex virus mutant[J].J Invest Dermatol，1997，108(6):933

[3]施桂兰,庄秀芬,韩香萍,等.新型溶瘤病毒oHSV2hGM-CSF的构建及其抗肿瘤作用[J].中华肿瘤杂志,2012,34(2):89

[4]SAHA D,WAKIMOTO H,RABKIN S D.Oncolytic herpes simplex virus interactions with the host immune system[J].Curr Opin Virol，2016，21(9):26

[5]ZHANG W,FULCI G,WAKIMOTO H,et al..Combination of oncolytic herpes simplex viruses armed with angiostatin and IL-12 enhances antitumor efficacy in human glioblastoma models[J].Neoplasia，2013,15(6):591

[6]MAHLLER Y Y,VAIKUNTH S S,CURRIER M A,et al.Oncolytic HSV and erlotinib inhibit tumor growth and angiogenesis in a novel malignant peripheral nerve sheath tumor xenograft model[J].Mol Ther，2007,15(2)：279

The Genome Stability of Recombinant Oncolytic HSV2 (OH2)

SUN Mei-ling，LI Yan-kun，LIU Bin-lei,et al

(SchoolofPharmacy,HubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100,China)

Objective To evaluate the genome stability of a recombinant oncolytic HSV-2 (OH2) modified with deletions for neural virulence gene ICP34.5 and immune suppressor gene ICP47,and insertion of the expression cassette for granulocyte macrophage colony stimulating factor(hGM-CSF)at the ICP34.5 site. Methods The HSV-1 and HSV-2 are distinguished by restriction fragments after PCR amplification.This experiment is designed based on gD glycoprotein conserved sequence in which HSV-1 has a MspI sequence.The OH2 modifications can be identified by PCR/agrose gel analysis with the primers designed from the sequences for deletion,insertion and down/up-stream flanking regions.hGM-CSF expression in OH2 culture supernatant can be validated by ELISA.Results The HSV1 has two fragments in 130bp and 70bp by enzyme digestion in identification experiment,while HSV-2 and OH2 have only one fragment in 200bp.OH2 virus can amplify the corresponding size of the strips under the four pairs of primers amplification in genetic modification experiments.The liner of hGM-CSF in range 31.25 500pg/mL is good,and the expression of hGM-CSF is more than 2ng/mL in OH2 virus.Conclusion The modified genes in OH2 virus genome are stable,and the hGM-CSF expression can be detected.

OH2 virus;Type identification;Genetic modification;ELISA test

湖北省自然科学基金面上项目(2014CFB186)

R373

A

2095-4646(2017)02-0097-04

10.16751/j.cnki.2095-4646.2017.02.0097

2016-12-03)

**通讯作者，E-mail：李炎坤：10833297@qq.com；刘滨磊：1836035949@qq.com