花药培养在中美水稻杂交新品系选育中的应用

余波+李闯+曾生元++景德道+林添资+钱华飞++周义文++姚维成+孙立亭+杜灿灿++龚红兵

摘要：以5份中国稻种质资源、2份美国稻种质资源为亲本，灵活运用单交、回交、花药培养等育种手段，实现中美水稻亲本之间有利基因的互补、叠加、纯合。通过对MS培养基的营养成分及其浓度进行精量调整，促进愈伤组织的诱导、分化，提高成苗率，选育出具有高产、优质、多抗、光温钝感广适性水稻新品系24份，按其株叶形态分为2类，其中改良型中国水稻18份，改良型美国水稻6份。

关键词：水稻；花药培养；美国稻；育种

中图分类号：S511.03文献标志码：A文章编号：1002-1302（2017）06-0065-03

水稻是我国最主要的粮食作物之一，我国有50%以上人口以稻米为主食，随着农业生产的发展和人民生活水平的不断提高，稻谷在粮食中的比重将继续增长。但是，在耕地资源有限的前提下，如何提高水稻单位面积的产量，对保障我国的粮食安全具有重要的意义。当前，水稻育种中产量长期停滞不前，品质和抗性也有待提高，其中一个重要的原因在于目前我国各地的主栽品种基因的遗传基础狭隘，育种工作者所选用的杂交亲本遗传差异小，很难使当前水稻的发展更上一个台阶。近年，有学者对中美两国水稻的基因遗传背景进行调查，发现其多态率（遗传差异）高达93.65%[1]。因此，推动水稻育种的国际化，使用不同国家水稻资源尤其是中美水稻材料进行杂交[2]，扩大杂交亲本之间的遗传差异，充分提高水稻的杂种优势，对当前的水稻育种乃至世界粮食的安全都有巨大的推动作用。

中美水稻亲缘关系较远，杂交后代分离疯狂且难于稳定[3]，育种选择难度大，如何提高中美水稻杂交的选育效果，加速后代稳定是一个需要解决的问题。花药培养是一种双单倍体育种方法，具有提高选择效率、缩短育种年限、纯合目标性状等众多优势，通过花药培养技术与常规育种技术相结合，可以快速稳定中美水稻杂交后代。本研究以中美两国水稻为亲本，灵活运用单交、回交等育种手段，实现中美水稻亲本之间有利性状的互补、叠加；借助花药培养技术快速稳定目标性状，实现中美水稻优良基因的聚合。

1材料与方法

1.1材料

中国稻种质资源5份：镇稻88、镇稻16号、镇稻18号、嘉禾218、H6/511；美国稻种质资源2份：DG9911772、P1002。

1.2方法

通过中国水稻与美国水稻单交、回交，取BC1F1、BC1F1′、F2稻穗进行花药离体培养，一方面选育适宜在中国种植的具有优质、高光效、光温钝感、综合农艺性状优良的中国水稻品系，另一方面选育适宜在美国生长的结实率高、单产高的美国水稻品系。

2中美水稻选育流程

以下以镇稻88与DG9911772杂交选育为例，结合图1、表1说明中美2种类型水稻新品系的选育流程。

（1）中美水稻杂交配组：使用江苏品种镇稻88，美国水稻资源材料DG9911772进行杂交配组F1代。

（2） 将步骤（1）中得到的F1代分别与镇稻88和美国稻资源材料DG9911772回交得到BC1F1、BC1F1′，再从BC1F1、BC1F1′中选单株分别进行花药离体培养，选育具有优质、高光效、光温钝感、综合农艺性状倾镇稻88的改良型单株，选育具有结实率高、单产高的倾DG9911772的改良型单株。

（3） 从F2中选综合农艺性状倾镇稻88、DG9911772单株分别进行花药离体培养，根据需要选育具有优质、高光效、光温钝感、综合农艺性状倾镇稻88的改良型单株；选育结实率高、单产高的倾DG9911772改良型单株，具有优势性状但还需要改良的中间材料分别与镇稻88和美国水稻DG9911772杂交，再利用花药培养加速稳定，实现目标性状的

改良。

（4）品系鉴定筛选：综合考虑产量、品质、抗性、光温反应等性状，选出最优品系进行优势鉴定。

3花药培養流程

由于中美水稻基因遗传背景的差异，花药培养使用三步成苗法，对诱导、分化、生根3个不同发育阶段的营养成分及浓度进行精量调整，促进愈伤组织的诱导、分化，提高成苗率。

3.1改良型MS培养基成分

3.1.1供试水稻材料花药培养所用培养基母液按10倍浓度计算，母液A（大量元素）包括如下组分：KNO3 30 g/L、NH4NO3 16.5 g/L、KH2PO4 5 g/L、MgSO4·7H2O 3.7 g/L、CaCl2 4.4 g/L。按100倍浓度计算，母液B（微量元素）包括如下组分：ZnSO4·7H2O 500 mg/L、MnSO4·H2O 1 000 mg/L、H3BO3 500 mg/L、CuSO4·5H2O 2.5 mg/L、KI 83 mg/L、Na2MoO4·2H2O 25 mg/L、CoCl2·6H2O 2.5 mg/L。按100倍浓度计算，母液C（铁盐）包括如下组分：Na2-EDTA 5.6 g/L、Fe2（SO4）3·7H2O 4.3 g/L。按100倍浓度计算，母液D（有机元素）包括如下组分：肌醇10 g/L、烟酸0.05 g/L、盐酸硫胺素0.05 g/L、盐酸吡哆醇0.05 g/L、甘氨酸0.2 g/L。

3.1.2供试水稻材料愈伤组织诱导培养基利用上述培养基母液配成1 L诱导培养基，包括：母液A 100 mL、母液B 10 mL、母液C 10 mL、母液D 10 mL、浓度为 1 mg/mL 的2，4-D 5 mL、蔗糖40 g、琼脂6 g、水解酪蛋白 1 g、山梨糖醇20 g、0.1 mg/mL的玉米素0.8 mL，pH值为58。

3.1.3供试水稻材料愈伤组织分化培养基利用上述培养基母液配成1 L分化培养基，包括：母液A 100 mL、母液B 10 mL、母液C 10 mL、母液D 10 mL、浓度为 2 mg/mL 的 6-BA 2 mL、浓度为0.5 mg/mL的NAA 0.5 mL、蔗糖30 g、琼脂6 g、水解酪蛋白1 g、山梨糖醇10 g，pH值为5.8。

3.1.4供试水稻材料生根培养基利用上述培养基母液配成1 L的生根培养基，包括如下组分：母液A 100 mL、母液B 10 mL、母液C 10 mL、母液D 10 mL、蔗糖30 g、琼脂6 g、水解酪蛋白1 g、山梨糖醇10 g、多效唑2 mg，pH值为5.8。

3.2花药接种方法

3.2.1诱导培养取孕穗期剑叶叶枕距3～5 cm的幼穗，在8～12 ℃预处理8～10 d，消毒；取花粉处于单核时期的花药接种在诱导培养基上进行离体培养；接种结束后将诱导培养基移至智能光照培养箱，关闭培养箱中灯管，并用报纸或黑布遮盖培养箱透光处，防止外界光线射入，设定箱内温度为 24～27 ℃，进行为期22～35 d的暗处理，形成愈伤组织。

3.2.2分化培养将诱导培养基中得到的愈伤组织转接到分化培养基上，将分化培养基移至智能光照培养箱，设定温度为24～27 ℃，设定光照时间为14 h/d，暗处理时间10 h/d。

3.2.3生根培养愈伤组织在分化培养基上经过16 d左右分化形成根和芽，长出绿色小苗，将绿色小苗从分化培养基中转接到生根培养基上；将生根培养基移至智能光照培养箱，设定温度为27 ℃，设定光照时间为14 h/d，暗处理时间 10 h/d。

3.2.4炼苗移植绿色小苗转入生根培养基培养3 d后，所有试管苗均开始发根，当试管苗绿苗长至6～8 cm，具有6～10条长0.5～1.0 cm的根时，从试管中取出绿苗，洗去根部培养基，清水培养；隔日移栽至花培苗圃中事先做好的秧田里，使用遮阳网遮盖；1周后移种大田。

3.3花培苗选育

综合考虑产量、品质、抗性、光温反应性，选出最优株系，次年进行鉴定筛选。通过2种美国水稻与5种中国水稻单交、回交、花药培养，共筛选出改良型株系24份（表2），按其株叶形态分为2类，其中改良型中国水稻18份，改良型美国水稻6份。

4讨论

4.1中美水稻杂交育种的优点

（1）有利于拓宽双亲的遗传距离，提高有利性状的遗传效应。借助单交、回交、聚合育种逐步实现中美优良性状（基因）的互补，无论是用我国的籼稻还是粳稻与美国水稻杂交，产量、品质、抗性等有利性状都得到极大提高。

（2）双亲亲和性好[4-5]，容易实现品种间杂交。由于仍然属于亚种内杂交，中美水稻之间杂交表现出较好的亲和性，如本研究中所用2个美国水稻（P1002、DG9911772）同5个中国水稻（镇稻88、 镇稻16号、镇稻18号、嘉禾218、H6/511）杂交，F1结实率都在70%以上。

（3）有利于品质改良、选育稳定的优质品种[6]。美国水稻所携带的优质基因不同于中国水稻品种，其优质性状受光

温条件影响小，如P1002、DG9911772在江苏种植和在海南种植其品质性状（尤其是垩白）均表现同一水平的优质，利用美国水稻这一特性，可使我国水稻的品质得以进一步改良，实现中美水稻优中选优。

（4）有利于培育光温钝感性品种，提高品种适应性。从表3可以看出，2个美国水稻材料分别在江苏句容与海南陵水种植，播种到齐穗所用时间仅相差3～6 d，表现为光温钝感；而中国水稻对光温条件表现为敏感，在江苏句容与海南陵水种植，播种到齐穗所用时间相差14～26 d。利用美国水稻对光温钝感这一特性，可以培育我国的光温钝感性品种，提高我国水稻品种的适应性。

（5）有利于培育综合性状优良的水稻新品系。美国水稻还具有抗倒伏性好[7-8]、叶片厚、对强光适应性强、光合效率高、成穗率高等优点，是改良我国水稻品种的理想材料。

4.2MS培养基改良效果

（1）同MS培养基相比，在诱导培养基、分化培养基、生根培养基中添加了水解酪蛋白（CH）、山梨糖醇这2种成分。水解酪蛋白（CH）是多种氨基酸的混合物，对胚状体、不定芽的分化有良好的促进作用，能提高诱导分化效率；山梨糖醇能够改善愈伤组织的质量，使绿苗分化率显著提高。

（2）同MS培养基相比，在诱导培养基中添加了玉米素。玉米素在与植物激素2.4-D混用的条件下，能快速促进愈伤组织的诱导。

（3）同MS培养基相比，在分化培养基中添加了NAA。NAA在与植物激素6-BA混用的条件下，可以快速促进愈伤组织的分化。

（4）同MS培养基相比，在生根培养基中添加了2 mg/L多效唑。可以克服组织培养中试管苗长势较弱，根系不发达的缺点，降低苗高，促进根系发育，健壮幼苗，提高移栽后成活率。

（5）使用三步成苗法，对诱导、分化、生根3个不同发育

阶段的营养成分及其浓度进行精量调整，更加有利于愈伤组织的诱导、分化，花药培养成苗、壯苗。

4.3花药培养在中美水稻育种中的意义

（1）有利于育种材料纯合，缩短育种年限。中美水稻之间遗传差异巨大，后代分离疯狂且难于稳定，花药培养是一种实现育种材料快速稳定的技术，借助花药培养的双单倍体育种技术，可以快速稳定育种材料。

（2） 有利于排除同一基因位点内的显性效应对后代选育的干扰，提高选择效率。由于花药培养所得到的组培苗是通过单倍体加倍形成的，其后代全部是纯合的基因型，排除了基因位点内的显性效应对后代选育的干扰，使不同基因位点非等位基因之间的加性效应、上位性效应得以充分表达，提高了选择效率。

（3）有利于打破优良基因与不良基因之间的连锁，实现中美水稻优良基因的聚合。中美水稻具有很多优良基因，但这些优良基因往往与不良基因之间存在着连锁关系，通过花药培养可以打破优良基因与不良基因之间的连锁，实现中美水稻优良基因的聚合。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.016