HPLC法测定胃疡宁丸中芍药苷的含量

何风雷+郑华珠+石洪超+李周+王利胜+彭富全+刘敏

[摘要] 目的 建立胃疡宁丸中芍药苷的高效液相色谱法（HPLC）测定方法。方法 采用甲醇控温25℃超声30 min提取芍药苷，采用Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱为色谱柱；甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（30∶70）为流动相；检测波长为230 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为25℃。结果 芍药苷浓度在5.60～112 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.9991），平均加样回收率为99.04%；7批样品中芍药苷含量均值为1.871 mg/g，转移率在62%左右。结论 本法操作简便、结果准确、重复性良好，可作为胃疡宁丸中芍药苷含量分析方法。

[关键词] 胃疡宁丸；芍药苷；高效液相色谱法；含量测定

[中图分类号] R917 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）03（c）-0133-04

Determination of Paeoniflorin in Weiyangning Pills by HPLC

HE Fenglei1 ZHENG Huazhu2 SHI Hongchao1 LI Zhou2 WANG Lisheng2 PENG Fuquan1 LIU Min1

1. Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Co. Chenliji， Guangzhou 510288， China； 2.School of Chinese Materia Medica， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510006， China

[Abstract] Objective To establish a determination method of Paeoniflorin in Weiyangning Pills by HPLC. Methods Methanol was used to extract Paeoniflorin at 25℃ for 30 min by the ultrasonic system， Diamonsil C18（250 mm ×4.6 mm， 5 μm） column was used as the column， methanol-0.05 mol/L Potassium dihydrogen phosphate solution （30∶70） was used as the mobile phase， detection wavelength was 230 nm and the flow rate was 1.0 mL/min， and the temperature was 25℃. Results The concentration of Paeoniflorin was linear in the range of 5.60-112 μg/mL， the average recovery was 99.04% （ r = 0.9991）.The average content of Paeoniflorin in the 7 batches of samples were 1.871 mg/g and the transfer rate was about 62%. Conclusion This method is simple， quick and accurate， for the determination of Paeoniflorin in Weiyangning Pills.

[Key words] Weiyangning Pills； Paeoniflorin； HPLC； Content determination

胃瘍宁丸由乌药、制白术、炒山药、白及、青皮、香附、赤芍、高良姜、仙鹤草、甘草、珍珠层粉和五指毛桃等12种药材组方而成[1]，具有温中散寒、制酸止血、理气止痛的功效，常用于治疗胃脘胀痛或刺痛、呕吐泛酸诸症[2]。现代研究表明，胃疡宁丸具有抗溃疡、促进胃肠黏膜修复[3]、促进胃肠运动[4]、抗炎镇痛[5]、止血[6]、抗幽门螺杆菌[7]等药理作用，对胃溃疡有显著的疗效。方中赤芍味苦，性微寒，归肝经，具有清热凉血、散瘀镇痛之功效。现代药理研究表明，赤芍主要含萜类及其苷类、黄酮类及其苷类、挥发油类等多种化学成分[8-9]，具有保肝[10]、抗肿瘤[11]、神经保护[12]、降血糖[13]、心脏保护、抗血小板聚集[14-15]、抗氧化[16]、抗内毒素等多种药理作用。有动物试验表明，芍药苷对哮喘小鼠的气道趋化因子及受体具有显著的抑制作用[17]。芍药苷是赤芍的主要活性成分之一，故本实验采用高效液相色谱法测定胃疡宁丸中芍药苷的含量，以期建立精密度、重复性、稳定性均较好，结果可靠，可用于胃疡宁丸质量标准的定量分析方法。

1 仪器与试药

1.1仪器

数控超声清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司，KQ5200DE型）；Waters 高效液相色谱仪（515泵，2487紫外检测器，美国waters公司）；N3000色谱工作站（浙江大学）；AUW120电子分析天平（SHIMADZU公司）。

1.2 试药

芍药苷对照品（批号：110736-201136，中国食品药品检定研究院）；赤芍药材（批号：140401，广州至信中药饮片有限公司）；磷酸二氢钾（色谱纯）；甲醇（色谱纯，DIKMA TECHNOLOGIES INC）；水（重蒸馏水，临用前制备）；成药样品（批号：EQ1221、EK1141、EK1151、C51006、FL1081、FL1061、C51007）由广州白云山陈李济药厂有限公司提供；阴性样品自制。

2 方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱；流动相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（30∶70）；检测波长为230 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；进样量：10 μL；理论塔板数按芍药苷峰计算不低于3000。

2.2溶液的制备

2.2.1供试品溶液的制备 精密称取胃疡宁丸0.5 g，加入2倍量硅藻土研细，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，密塞，称定重量，控温25℃超声处理（功率90 W，频率50/60 kHz）30 min，放冷，再称定其重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.2对照品溶液的制备 精密称取2.8 mg芍药苷对照品，置10 mL容量瓶内，加甲醇溶解至刻度，摇匀，制成0.28 mg/mL的储备液。分别取对照品储备液0.1、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL定容至5 mL，配制成不同浓度的对照品溶液。

2.2.3对照药材溶液的制备 精密称取赤芍药材0.1 g，同供试品溶液制备方法制备对照药材溶液。

2.2.4赤芍阴性对照溶液的制备 按处方中药味的比例，配制不含赤芍的群药，按其工艺制成赤芍阴性对照样品，精密称取0.5 g再按供试品溶液的制备方法制备赤芍阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1系统适用性试验与专属性考察 在“2.1”项色谱条件下，取芍药苷对照品储备液、对照药材溶液、供试品溶液、阴性样品溶液分别进样10 μL，色谱图见图1。由图1可见，在本实验条件下，芍药苷的保留时间约为11.60 min，芍药苷与其相邻峰可达基线分离。阴性对照无干扰，胃疡宁丸中芍药苷色谱峰与其他组分色谱峰分离度良好。

2.3.2 线性关系的考察 精密称取芍药苷对照品2.80 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为280 μg/mL的储备液；分别吸取上述芍药苷储备液0.1、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL置5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，分别制成浓度为5.60、22.4、33.6、44.8、56.0、112 μg/mL的系列标准溶液，各进样10 μL，测定，重复3次。以峰面积为纵坐标，以浓度（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=19 905X-36 955，r=0.9991。结果表明芍药苷浓度在5.60～112 μg/mL 范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.3 精密度试验 精密吸取同一份对照品溶液（44.8 μg/mL），连续进样5次，测定芍药苷各峰面积。结果峰面积的RSD为0.25%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批次样品（批号C51007）6份，按“供试品溶液的制备”方法制备样品溶液。在上述色谱条件下，测定芍药苷的峰面积。结果峰面积的RSD为1.12%，表明该方法的重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一批次样品（批号C51007），分别于0、2、4、8、12、24 h精密吸取10 μL，按“2.1”项下液相色谱条件进样分析，测定芍药苷峰面积。结果峰面积的RSD为0.309%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取胃疡宁丸样品（批号EK1151）6份，每份精密称取0.25 g，加入2倍量硅藻土研匀，置具塞锥形瓶中，称定重量，依次分别每组添加等量芍药苷对照品（含芍药苷0.55 mg），依法制成供试品溶液，按色谱条件测定，计算得平均回收率为99.04%，RSD为3.50%，见表1。

表1 芍药苷的加样回收率

2.4 样品含量测定

取胃疡宁丸7批，按“2.2.1”项供试品溶液的制备方法制备。在“2.1”项色谱条件下测定各批次供试品芍药苷含量，见表 2。由表2可知，各批次样品所用赤芍药材中芍药苷平均含量为3.018 mg/g，成品胃疡宁丸中芍药苷平均含量为1.871 mg/g，由此计算所得样品中芍药苷转移率在62%左右。表明此提取工艺较优，能减少生产成本，提高效益。

表2 样品芍药苷含量测定

3 讨论

3.1提取溶剂的考察

芍药苷的常用提取溶剂有甲醇、50%乙醇和30%乙醇，故本实验对这3种提取溶剂进行了考察；实验中发现50%乙醇和30%乙醇超声提取后提取液过于黏稠，难以滤过，不利于含量测定，可能与胃疡宁丸剂中蜂蜜含量较大有关。高效液相色谱结果表明，甲醇超声提取后，样品中的芍药苷能得到很好的分离，且操作简便，故本实验选择甲醇作为提取溶剂。

3.2超声时间的确定

超声提取技术可以简化操作流程，缩短处理时间，提高分离效率[18]。查阅文献[19-21]可知，在制剂的芍药苷含量测定中超声提取处理的方法也经常使用。因此本文采用超声提取芍药苷，并考察最佳超声时间。精密称取胃疡宁丸0.5 g，加入2倍量硅藻土研细，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，密塞，称定重量，分别控温25℃超声处理（功率90 W，频率50/60 kHz）15、30、45 min，放冷，再称定其重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。分别吸取各样品10 μL，按“2.1”项下液相色谱条件进样分析，测得芍药苷含量分别为2.103、2.154、2.149 mg/g，结果表明超声30 min之后，样品溶液中芍药苷的含量不再增加反而减少，说明超声30 min已经提取完全，故確定样品的超声时间为30 min。

采用甲醇超声提取30 min可使胃疡宁丸中芍药苷较大程度地溶出；样品中芍药苷的转移率在62%左右，可能是提取过程中化学成分发生变化所致；通过线性考察、精密度试验、加样回收试验等一系列方法学考察，证明本文建立的高效液相色谱法灵敏度高、简便、准确、快速、重现性好，可作为胃疡宁丸中芍药苷含量测定的方法。

[参考文献]

[1] 李诗慧，何广俊，卢映，等. HPLC法测定胃疡宁丸中乌药醚内酯的含量[J].中国医药指南，2015，13（6）：32-33.

[2] 中华人民共和国卫生部.中药成方制剂药品标准.胃疡宁丸[S].WS3-B-3935-98.

[3] 徐晶晶，黄萍，吴清和，等.胃疡宁丸抗实验性胃溃疡的药效及机制研究[J].中国中藥杂志，2013，38（5）：736-739.

[4] 刘静，黄萍，吴清和，等.胃疡宁丸对胃肠运动影响的研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（10）：273-275.

[5] 黄思明，梁志健，操红缨，等.胃疡宁丸抗炎镇痛的药效研究[J].中药与临床，2015，6（2）：64-67.

[6] 文思，黄萍，吴清和，等.胃疡宁丸止血作用及其机制实验研究[J].辽宁中医药大学学报，2013，15（6）：26-27.

[7] 许艺飞，江伟雯，邝兆进，等.胃疡宁丸体内外抗幽门螺杆菌的实验研究[J].中药新药与临床药理，2014，25（5）：572-576.

[8] 段文娟，姜 艳，靳鑫，等. 赤芍的化学成分研究[J].中国药物化学杂志，2009，19（1）：55-58.

[9] 陆小华，马 骁，王建，等.赤芍的化学成分和药理作用研究进展[J].中草药，2015，46（4）：595-602.

[10] 卢丹. 赤芍保肝退黄药效物质基础研究[D].南京：南京中医药大学，2010.

[11] Lin MY， Chiang SY， Li YZ， et al. Anti-tumor effect of Radix Paeoniae Rubra extract on mice bladder tumors using intravesical therapy[J].Oncol Lett，2016， 12 （2）： 904-910.

[12] Gu J ， Chen J ， Yang N， et al. Combination of Ligusticum chuanxiong and Radix Paeoniae ameliorate focal cerebral ischemic in MCAO rats via endoplasmic reticulum stress-dependent apoptotic signaling pathway[J].J Ethnop？鄄harmacol，2016，7（187）： 313 - 324.

[13] 李芳芳. 赤芍降血糖作用研究 [D]. 开封：河南大学，2015.

[14] Chang CC， Yuan W， Lin YL， et al. Evaluation of the in vivo therapeutic effects of radix paeoniaerubra ethanol extract with the hypoglycemic activities measured from multiple cell-based assays[J]. Evid Based Complement Alternat Med， 2016， 3262790： 1 - 11.

[15] 王忠良. 赤芍与白芍的药理作用比较[J].中国继续医学教育，2016，8（3）：199-200.

[16] 张凯，王学智，张景艳，等. 赤芍？何首乌和发酵黄芪提取物抗氧化作用研究[J].黑龙江畜牧兽医，2013，8（15）：125-127.

[17] 刘家齐，赵正晓，魏颖，等.芍药苷对哮喘模型小鼠气道炎症趋化因子及受体的干预作用[J].中国实验动物学报，2016，24（5）：460-464.

[18] 秦梅颂.超声提取技术在中药中的研究进展[J].安徽农学通报，2010，16（13）：54-55.

[19] 王正宽，石晓朦，杨素德，等. 小青龙颗粒微波？超声提取工艺的比较[J].中成药，2016，38（11）：2375-2379.

[20] 刘微，李冬冬，杨洪帅，等.超声辅助离子液体-反相液相色谱法测定赤芍中齐墩果酸和芍药苷的含量[J].中国中药杂志，2015，40 （3）： 443 -449.

[21] 王玎，王利胜，巴文强，等.HPLC同时测定补阳还五汤提取液中4 种成分的含量[J].中国实验方剂学杂志，2015， 21（9）：46-49.

（收稿日期：2016-12-20 本文编辑：王 丽）