野葛和粉葛不同溶剂提取物清除DPPH自由基活性的比较

刘琳　李生茂　袁斌　舒波　张世鹏

[摘要]目的：比较野葛和粉葛清除DPPH自由基的活性。方法：分别用乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿和石油醚对野葛及粉葛药材进行提取，DPPH法测定抗氧化活性并计算IC50。结果：野葛乙醇、丙酮和乙酸乙酯提取物清除DPPH自由基的IC50值分别是2.6334、17.5689、42.1171mg/mL（生药），氯仿和石油醚提取物200mg/mL（生药）浓度时DPPH自由基清除率分别为18.03%、9.48%。粉葛乙醇提取物清除DPPH自由基的IC50值是12.4629mg/mL（生药），而丙酮、乙酸乙酯、氯仿和石油醚提取物200mg/mL（生药）浓度时对DPPH自由基清除率分别为45.97%、15.03%、10.82%、7.65%。结论：野葛和粉葛各溶剂提取物均具有不同程度的清除DPPH自由基的活性，活性大小顺序均为：乙醇提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物>石油醚提取物，相同溶剂的提取物野葛清除DPPH自由基的活性较粉葛强。

[关键词]野葛；粉葛；提取物；DPPH

葛根始载于《神农本草经》，列为中品，为中医临床常用药之一，具有解肌退热、生津止渴、透疹、升阳止泻、通经活络、解酒毒之功效。文献报道，葛根含有异黄酮、葛酚苷、香豆素和三萜皂苷等类化学成分，具有降低血压、减缓心率、心肌缺血保护、抗心律失常、抗氧化、降血糖和改善肝脏脂代谢等药理作用。其中抗氧化是葛根重要的药理活性之一，葛根提取物、异黄酮或葛根素等体外具有清除DPPH自由基、羟基自由基、氧自由基或超氧阴离子的作用，并可降低多种动物模型丙二醛含量，升高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶或过氧化氧酶等的活性。

历代医家对葛根植物来源认识不一，豆科葛属植物野葛（Pueraria lobata（Willd.）ohwi）和甘葛藤（Pueraria thomsonii Benth.）等的干燥根均作为葛根药材使用，分别为葛根（野葛）和粉葛，并认为野葛侧重于解肌透疹、升阳，粉葛偏于清热解肌、生津止渴、醒脾解酒、解毒，《中国药典》自2005年版开始亦将野葛和粉葛单列收载。现代研究显示，野葛和粉葛化学成分和药理作用均有一定的差异，但未见有二者抗氧化活性的比较研究。因此，本实验采用DPPH法比较了野葛和粉葛不同溶剂提取物的抗氧化活性，以期为合理开发利用野葛和粉葛药材提供一定的实验依据。

1.仪器与材料

1.1仪器 岛津1750紫外分光光度计（日本岛津公司）；HH-2K4型恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）；Ohaus Discovery十万分之一电子分析天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司）；KQ3200型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Epoch微孔板分光光度计（美国BIOTEK公司）。

1.2试剂 1，1-二苯基苦基苯肼（批号：034K1071，sigma公司）；乙醇（批号：2013091301，成都市科龙化工试剂厂）；丙酮（批号：1511211，西陇化工股份有限公司）；乙酸乙酯（批号：20160110，天津市致远化学试剂有限公司）；氯仿（批号：2015012701，成都市科龙化工试剂厂）；石油醚（60～90℃，批号：2013092701，成都市科龙化工试剂厂），均为分析纯。

1.3受试药物 野葛和粉葛分别购于安徽亳州中药材批发市场和四川南充苍生大药房，经川北医学院药学院杨兰讲师鉴定为豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi、甘葛藤Pueraria thomsonii Benth.的干燥根。

2.方法

2.1样品溶液制备 取野葛或粉葛粗粉5份，每份1g，精密称定，分别加入20mL乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿和石油醚，超声提取0.5h，滤过，滤液置水浴（60℃）挥尽溶剂，加甲醇溶解并定容至5mL容量瓶，即得。

2.2DPPH溶液配制 精密称取DPPH适量，加甲醇配置成110btmol/L的溶液，避光保存。

2.3提取物对DPPH自由基清除作用 参考文献，取“2.1”项下各样品溶液，用甲醇稀释成不同浓度供试品溶液。取0.15mL供试品溶液与0.15mL DPPH溶液置96孔板，混匀后室温避光放置180min，517nm处测定吸收度Ai；同时测定0.15mL甲醇+0.15mL DPPH溶液的吸光度A0，6个复孔，按公式计算清除率：DPPH自由基清除率=（1-Ai/A0）×100%。以清除率（Y）对药物浓度（x）对数进行线性方程回归，根据对数函数方程求出清除率为50%时药物的浓度（IC50）。

3.结果

3.1测定波长的选择 分别观察了DPPH、加入野葛乙醇提取物的DPPH、野葛及粉葛各溶劑提取物的甲醇溶液在200～700nm的紫外光谱，发现DPPH甲醇溶液在517nm处有强吸收峰，在加入野葛乙醇提取物后，517nm处的峰值均明显降低。野葛及粉葛乙醇、野葛丙酮和乙酸乙酯提取物的甲醇溶液在240～280nm和300～340nm处分别有较强的吸收峰和明显的肩峰，而各溶剂提取物在517nm处没有吸收，故选择517nm作为测定波长。见图1。

3.2样品测定 野葛和粉葛的5种溶剂提取物对DPPH自由基均有不同程度的清除作用，并随浓度的增加清除活性增强。两种葛根药材不同溶剂提取物对DPPH自由基清除能力的强弱顺序均为：乙醇提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物>石油醚提取物，其中野葛乙醇、丙酮和乙酸乙酯提取物提取物具有较强的清除DPPH自由基的活性，IC50值分别是2.6334、17.5689、42.1171mg/mL（生药），氯仿和石油醚提取物则清除活性较弱，200mg/mL（生药）浓度时对DPPH自由基清除率分别为18.03%、9.48%（未测出IC50值）。而粉葛乙醇提取物具有较强的清除DPPH自由基的活性，IC50值分别是12.4629mg/mL（生药），而丙酮、乙酸乙酯、氯仿和石油醚提取物清除活性较弱，200mg/mL（生药）浓度时对DPPH自由基清除率分别为45.97%、15.03%、10.82%、7.65%（未测出IC50值）。两种葛根药材相同溶剂的提取物清除DP-PH自由基的活性比较，则是野葛提取物清除自由基的活性强于粉葛，结果见图2。

4.讨论

体外评价抗氧化能力的方法有很多，常用的有ORAC法、ABTS法、DPPH法、羟基自由基清除能力法、超氧阴离子清除能力法、FRAP法、FC法、DNA氧化损伤法、脂质过氧化法、红细胞溶血法和线粒体肿胀法等。其中，DPPH法具有简便快速等特点，为目前应用最广泛的一种体外抗氧化活性评价方法，其原理为DPPH自由基在甲醇（乙醇）溶剂中呈紫色，在515～520nm范围内有最大吸收，当自由基清除剂提供电子与DPPH自由基的孤电子配对时，DPPH自由基会褪色，其褪色程度与接受的电子数成定量关系，故可以通过吸光度的变化进行定量分析。

实验在采用乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿和石油醚对野葛和粉葛分别进行提取获得不同极性溶剂提取物的基础上，通过DPPH法比较了抗氧化活性的差异。结果表明，野葛和粉葛各溶剂提取物均具有不同程度的清除DPPH自由的活性，并呈明显的量效关系。同时，随提取溶剂极性的降低，清除活性减弱，其活性的强弱顺序依次为：乙醇提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物>石油醚提取物。而两种药材相同溶剂提取物清除DPPH自由的活性也有明显差异，野葛抗氧化的活性明显优于粉葛。进一步对各提取物的紫外光谱数据分析并结合文献报道，发现野葛及粉葛乙醇、野葛丙酮和野葛乙酸乙酯提取物的甲醇溶液具有典型的异黄酮类成分的紫外光谱特征，推测其所含异黄酮类成分可能是野葛及粉葛发挥清除DPPH活性的主要成分。