大白菜叶柄黑点症细胞显微结构观察

2017-05-11雷娟利李必元王五宏岳智臣赵彦婷钟新民

浙江农业科学 2017年4期

关键词：细胞器小黑点细胞壁

雷娟利，李必元，王五宏，岳智臣，陶鹏，赵彦婷，钟新民

(浙江省农业科学院蔬菜研究所，浙江杭州 310021)

大白菜叶柄黑点症细胞显微结构观察

雷娟利，李必元，王五宏，岳智臣，陶鹏，赵彦婷，钟新民*

(浙江省农业科学院蔬菜研究所，浙江杭州 310021)

通过光学和电子显微镜技术对大白菜叶柄黑点症细胞显微结构进行观察研究。光学显微镜观测结果表明，大白菜叶柄上的黑点少则由2～3个细胞、多则由20～30个细胞组成；电子显微镜观测发现，发生黑点症的细胞细胞壁扭曲变形、叶泡和线粒体等细胞器降解破坏、多泡体形成、细胞核形状发生改变、质壁分离等典型的植物细胞程序化死亡的基本特征，由此推测，大白菜叶柄黑点症是大白菜在受到过量氮肥等逆境条件下发生植物细胞程序性死亡的结果。

大白菜；叶柄黑点症；显微结构；细胞壁；植物细胞程序性死亡

大白菜起源于中国，营养较丰富(含有蛋白质、脂肪、多种维生素和多种矿物质及大量的膳食纤维)，具有悠久的栽培历史，是历代劳动人民长期培育出来的中国特产蔬菜。大白菜叶柄黑点症严重影响大白菜的品质，降低商品价值，给生产者、经营者和消费者造成巨大损失。大白菜叶柄黑点症是指大白菜结球叶叶柄表面发生的小黑点样病变，这种小黑点样病变可发生于叶柄内外侧，尤其以内侧表面更为严重，有时也可发生在叶脉处的内外侧表面。病斑主要集中在表皮层细胞，少有的也发生在叶肉细胞。病斑大小多为1～2 mm，有的病斑则需放大镜才可见。病斑发展到后期，可使叶柄发生褐变及表皮开裂以至腐烂。除生长过程外，大白菜叶柄黑点症在贮藏过程中还会加重，甚至在收获时没有病征的大白菜在贮运中也能发生。另外，反季节栽培的大白菜，叶柄黑点症发生更严重。杨晓云等[1-2]根据其表现特征及英文名称称之为“大白菜小黑点病”或“大白菜芝麻状斑点病”。

引起大白菜叶柄黑点症发生的机制尚不完全清楚。已有研究表明，大白菜叶柄黑点症是一种生理性病害，为基因型和环境因素共同作用的结果，过量施用N肥是引起此症的重要因素[3]。本课题组研究发现，有机肥也可影响大白菜叶柄黑点症的发生[4]。到目前为止，未见有关对大白菜叶柄黑点症开展过细胞显微结构观察研究的相关报道。本文对大白菜叶柄黑点症细胞进行了光学和电子显微镜的观察研究，从细胞水平对大白菜叶柄黑点症发生的机理进行了探讨，为大白菜叶柄黑点症的发生机制研究及抗性育种工作提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为浙江省农科院杨渡基地大白菜甘蓝课题组的大白菜材料，取自2013春至2015年春，对其进行叶柄黑点症观察、拍照，并取样用于光学及电子显微镜观察。

1.2 光学显微镜样品制备与观察

从田间取回的样品，用自来水清洗，用吸水纸吸干净水分，取有黑点症状的部分进行光学显微镜观察、拍照。

1.3 透射电镜样品制备与观察

将从田间取回的样品用自来水清洗，用吸水纸吸干净水分，包含黑点取0.1 cm×0.5 cm叶样，迅速投入5%的戊二醛(0.1 mol·L-1PBS，pH值7.0配制)内固定，抽气直到材料下沉为止，于4 ℃冰箱中固定24 h，用0.1 mol·L-1PBS冲洗，而后用1%饿酸溶液固定4 h，再经双重蒸馏水冲洗，乙醇系列脱水，Epon812环氧树脂包埋，徕卡公司UC6型超薄切片机切片，经醋酸双氧轴和柠檬酸铅染色，于日立公司H-7650型透射电镜下观察、拍照。

2 结果与分析

2.1 大白菜叶柄黑点症田间各种症状

大白菜叶柄黑点症的典型症状是叶柄表面出现黑褐色的小点，黑点大小以1～2 mm较常见(图1中A)，也有的黑点大小仅为0.1～0.5 mm，在叶柄表面呈又密又小淡黑色的一片(图1中B)。黑点症状一般发生在叶柄内表面，也经常发生在叶柄的外表面或叶脉处(图1中C)。黑点大多都发生在叶柄的表皮细胞，也有的发生在叶肉细胞(图1中D)，在大白菜生长后期，叶柄黑点症常表现为叶柄发生褐变(图1中E)、叶柄表皮开裂(图1中F)，甚至腐烂(图1中G)。总之，叶柄黑点症的症状有多种表现形式，因品种、环境因素及生育期的不同而异。

2.2 大白菜叶柄黑点症细胞光学显微镜观察结果

图2看出，对大白菜叶柄黑点症发病叶柄上的小黑点在光学显微镜下观察可知，1～2 mm黑点通常发病细胞由几十个细胞组成，整个细胞壁都有黑色物质沉积，细胞内也呈淡黑褐色，大液泡已遭破坏(图2中A)。黑点又密又小的发病细胞仅为几个，黑色物质仅局限在边角处，大液泡尚可见(图2中B)。对叶肉细胞发病的黑点进行观察可知，表皮细胞大液泡清晰可见，黑色物质在表皮下(图2中C)。

A为大液泡已遭破坏，B为大液泡尚可见，C为黑色物质在表皮下图2 大白菜叶柄黑点症细胞光学显微镜观测结果

2.3 大白菜叶柄黑点症电子显微镜观察结果

如图3中A～C为正常的大白菜叶柄表皮细胞，可看到细胞丰满，大液泡几乎充满整个细胞，细胞器被挤到细胞壁附近薄薄的一层。放大可见细胞器完整，边界清晰。图3中D～L为发生黑点症的细胞。从图3中D可见，发病细胞细胞壁扭曲变形，细胞角质层明显增厚，扭曲变形处有黑色物质，放大后由图3(E～F)可见，有的细胞器外形已不可见，有的细胞器膜上则布满小黑点。结果表明，黑点症的细胞壁发生严重扭曲变形，内部细胞器遭到严重破坏，细胞已死亡。

A～C为正常的大白菜叶柄表皮细胞，D为发病细胞，E～F有的细胞器外形已不可见，有的细胞器膜上则布满小黑点，G为正在发病的细胞器，H为开始发生质壁分离的细胞，J～K为细胞膜上形成的一个嵴状结构，L是一变形细胞核图3 大白菜叶柄黑点症细胞电子显微镜观测结果

图3中G显示的是正在发病的细胞器，可见一个基本正常的细胞器，然后其他细胞器的膜上开始出现黑色物质，黑色物质越来越多，细胞形状逐渐消失。可见液泡膜和细胞膜上也有黑色物质沉积，部分液泡膜已遭到破坏。图3中H显示的是一个开始发生质壁分离的细胞部分，细胞器受损变形，细胞膜也受损变形，且与细胞壁发生了分离。图3中I显示的是一个几乎完整发生质壁分离的细胞，细胞壁已稍有变形。

图3(J～K)显示细胞膜上形成的一个嵴状结构，在一个基本正常的表皮细胞里由细胞膜处衍生出一个较大的嵴状结构(图3中J)，放大后发现，是由一层层的膜构成的，且中间膜较疏松，而外部的膜则较紧密(图3中K)。这种嵴状结构一般在植物遇到逆境胁迫时出现，表明叶柄黑点症的发生是受到某种逆境胁迫。

图3中L是一个变形细胞核，细胞核不再是圆润的，而是皱缩的，且产生了许多指状结构，表明细胞核也受到了破坏。

3 小结与讨论

大白菜叶柄黑点症是一种生理性病害，过量施用N肥是本病加重的一个重要因素。刘东等[4]开展了氮素浓度对大白菜小黑点病发生的影响，结果均表明，氮浓度对感病品系03B9和P8-2的细胞膜透性和 MDA 含量的影响比抗病品系C24和P8-1大，推测感病品系细胞膜结构遭到破坏，使细胞膜透性增大并发生脂膜过氧化反应，表现出电导率增大及MDA含量的升高，这可能是小黑点发生的原因。在本研究中，通过电子显微镜观察结果证实了这一推测，在多张不同的照片中显示了细胞器膜，液泡膜及细胞膜遭到了破坏。而发展的过程是先有黑色物质在细胞膜上沉积，随着黑色物质的增加，细胞膜逐渐受到降解破坏。这表明大白菜叶柄黑点症的发生与细胞膜受损有关。

植物细胞程序性死亡(programmmed cell death，PCD)普遍存在于植物体生长发育过程中，是由特定基因控制的细胞主动死亡的现象。植物细胞程序性死亡不仅对正常植物的生长发育是必不可少的，而且在抵御病原体入侵及植物响应非生物环境胁迫过程中也起着重要的作用[5]。本研究中发现了许多现象，如细胞壁的扭曲变形、细胞核畸形、多泡体出现、细胞质壁分离等都是典型的植物细胞程序性死亡的基本特征。因此，大白菜叶柄黑点症也可能是大白菜在过量氮肥等逆境条件下的植物细胞程序化死亡的结果。

细胞壁扭曲变形是引起大白菜叶柄黑点症发展后期表皮开裂的主要原因，由于表皮层开裂，使内部细胞失去保护，导致病原微生物进入，进而引起叶柄腐烂。

[1] 杨晓云，张淑霞，张清霞，等. 氮肥对大白菜生理障害——小黑点病发生影响的初步研究[J]. 华北农学报，2006，21(增刊)：151-153.

[2] 郭莹，杨晓云，司朝光，等. 不同形态氮素营养对大白菜芝麻状斑点病发生的影响[J]. 园艺学报，2011，38(8)：1489-1497.

[3] 雷娟利，钟新民，李必元，等．有机肥对大白菜叶柄黑点症及叶缘黑点症的影响[J]．浙江农业科学，2015，56(10)：1593-1597.

[4] 刘东，杨晓云，王媛，等. 氮素浓度对大白菜小黑点病发生的影响[J]. 中国农学通报，2010，26(11)：303-307.

[5] 李云霞，程晓霞，代小梅，等. 植物在逆境胁迫中的细胞程序性死亡[J]. 生物技术通报，2009(4)：7-11.

(责任编辑：张瑞麟)

2017-01-18

浙江省自然科学基金(LY14C150003)；浙江省重点创新团队“园艺作物育种技术创新团队”项目(2013TD05)

雷娟利(1971—)，副研究员，博士，从事白菜抗病育种研究工作，E-mail: juanlil@126.com。

钟新民，研究员，E-mail:zxmlly@hotmail.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170443