农用真菌抑菌剂对白及种子萌发及小苗生长分化的影响

2017-05-11赵双双潘洁莉蒋福升丁志山李美芽

浙江农业科学 2017年4期

关键词：抑菌剂百菌小苗

赵双双，潘洁莉，刘巧，蒋福升，陈开，丁志山，李美芽*

(浙江中医药大学a.生命科学学院， b.分析测试中心，c.医学技术学院，浙江杭州 310053)

农用真菌抑菌剂对白及种子萌发及小苗生长分化的影响

赵双双a，潘洁莉b，刘巧c，蒋福升a，陈开a，丁志山c，李美芽b*

(浙江中医药大学a.生命科学学院， b.分析测试中心，c.医学技术学院，浙江杭州 310053)

测定农用真菌抑菌剂百菌清、多菌灵和代森锰锌对白及组培中常见污染真菌的抑菌活性，同时探讨这些抑菌剂对白及种子萌发和小苗分化生长的影响，以减少白及组培污染，提高组培效率。结果表明，3种抑菌剂对分离纯化的6种白及常见污染真菌均具有较好的抑菌效果，其中多菌灵和代森锰锌0.05%浓度可完全抑制真菌生长，但代森锰锌对白及种子萌发和小苗生长毒性较大，不适宜作为组培添加剂；多菌灵0.05%以上浓度对白及小苗生长抑制较为明显，但0.05%浓度对种子萌发影响较百菌清小；百菌清0.05%浓度对白及种子萌发影响相比多菌灵明显，对小苗生长发育影响却较小。进一步组培试验表明，添加0.05%浓度的多菌灵可使白及种子母瓶污染率从30%降低至2%，抑菌效果明显且不影响种子萌发。因此，0.05%多菌灵适合用于白及种子萌发，而0.05%百菌清适合用于后继分化和生长育苗。

真菌抑菌剂；白及；萌发；分化

中药白及具有收敛止血，消肿生肌等功效[1]，长期以来主要靠采集野生资源供应市场需求，由于遭受破坏掠夺式采挖，目前野生资源匮乏，价格连年攀升，已超过800元·kg-1。为了解决这一药用资源问题，课题组开展了白及组培快繁研究工作。前期研究发现，以白及果荚为材料进行组织培养，母瓶接种污染率有时高达30%以上，且多为真菌污染，这给组培生产带来了极大浪费，也大大提高了生产成本。为了尽量降低组培成本，控制组培污染率提高生产效率是第一要务。一般企业要求污染率不高于5%，显然，白及母瓶污染率非常之高，对产业化极为不利。因此，有必要采取合理措施，以有效降低污染率来提高生产效率。组培污染是相关生产企业面临的共性问题，为此已有不少学者通过在培养基中添加不同抑菌剂，来探讨其降低组培污染率提高生产效率的可行性[2-4]，并取得了较为满意的效果。鉴于白及组培主要是真菌污染，因此，本研究选用代森锰锌、多菌灵和百菌清这3种常用农用抑菌剂进行研究，探讨其对白及常见污染真菌的抑制活性，同时分析其对白及种子萌发和小苗生长分化的影响，以便为后续产业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

超净工作台(上海比郎BL6-180A)，高压灭菌锅(日本Tomy)，电子天平(赛多利斯，BS110S)，恒温培养箱(上海博迅，HPX-9082)，PDA培养基(杭州微生物试剂有限公司)，MS培养基(美国sigma公司)，其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 白及果荚消毒保存

白及果荚于2015年10月10日采自湖北省武穴市梅川镇，经75%乙醇消毒5 min，0.1%升汞消毒20 min，然后35 ℃干燥至种子水分含量在5%～10%，4 ℃保存备用。

1.2.2 白及种子母瓶接种培养及污染情况分析

取上述已消毒干燥处理过的果荚，无菌操作接种于MS液体培养基中，每颗种子接种3瓶，共接种198瓶，于25 ℃，3 000 lx光照下培养，每天光照培养12 h，培养20 d后统计污染率。

1.2.3 白及母瓶培养常见污染真菌分离培养

收集1.2.2中污染真菌，接种于PDA培养基中，置于28 ℃，90%湿度恒温培养箱中倒置培养，并采用菌丝顶端纯化法[5]分离、纯化各污染真菌。

1.2.4 农用抑菌剂对上述分离真菌抑制活性分析

向PDA培养基中加入不同浓度的农用抑菌剂(百菌清、多菌灵和代森锰锌)，配成系列固体培养基。采用切块法接种上述分离真菌，置于28 ℃，90%湿度恒温培养箱中倒置培养9 d，测定直径，分析各浓度抑菌剂对白及常见污染真菌抑制活性。

1.2.5 农用抑菌剂对白及种子萌发影响

分别称取各抑菌剂适量，分散于MS固体培养基中，配成含抑菌剂浓度分别为0.05%、0.1%、0.2%、0.4%的4种浓度的处理组，每组重复3次，121 ℃高压灭菌30 min备用。无菌操作接种白及种子，置于25 ℃，3 000 lx光照下培养，每天光照培养12 h，培养20 d后统计种子萌发情况，分析不同抑菌剂不同浓度对白及种子萌发的影响。

1.2.6 农用抑菌剂对白及小苗分化、生长影响

分别称取各抑菌剂适量，分散于MS固体培养基中，配成含抑菌剂浓度分别为0.05%、0.1%、0.2%、0.4%的4种浓度处理组，每组3个重复，121 ℃高压灭菌30 min备用。无菌操作接种已经在MS培养基中萌发30 d的白及小种球，置于25 ℃，3 000 lx光照下培养，每天光照培养12 h，继续培养2个月后统计分析各抑菌剂对白及小苗分化、生长影响。

1.2.7 数据分析

结果以均数±标准差(x±s)表示，利用SPSS 13.0对数据进行分析处理，不同组间比较采用一维方差分析，P<0.05表示具有显著性差异，P<0.01表示具有极显著差异。

2 结果与分析

2.1 白及种子母瓶接种污染率高

经消毒处理的白及果荚接种于MS培养基中培养20 d后统计污染情况。由图1可知，白及果荚经上述消毒接种污染率较高，其中细菌污染率在4%左右，真菌污染率高达30%左右，且污染的真菌类型较多。有些真菌直接抑制白及种子萌发，有些种子虽能萌发，但很快褐化死亡，有些虽无明显毒性，种子也能生长，但可能由于营养竞争而长势较慢。白及果荚接种污染率高可能与白及果荚采集时间太晚、果荚开裂从而引发感染有关，也可能与其含有丰富的内生菌有关[6]。

最后一张为正常无污染母瓶图1 白及母瓶真菌污染情况

2.2 农用抑菌剂对白及污染真菌抑制作用

通过PDA顶端纯化法共分离纯化上述白及常见污染真菌6株，切块法接种于含有各抑菌剂的PDA培养基中，置于28 ℃，90%湿度恒温培养箱中倒置培养9 d，测定直径，分析各抑菌剂对白及常见污染真菌抑制活性。从表1中可以看出，多菌灵与代森锰锌对6株白及常见污染真菌抑制效果较好，在0.05%浓度下，只有6号菌株有一定生长，其他生长全部得到完全抑制；百菌清在0.1%浓度下，除4号菌株有一定生长外，其他全部得到完全抑制，0.05%浓度时大部分生长抑制也比较明显；总体上4号和6号菌株耐药性相对较强。

表1 不同抑菌剂浓度对6株白及常见污染真菌抑制活性的影响

2.3 农用抑菌剂对白及种子萌发影响

抑菌剂在一定剂量范围内往往对植物体也有一定的生长抑制或毒性，因此必须对其安全性进行评价。本研究对各抑菌剂设立4个浓度梯度，探讨其对白及种子萌发和幼苗生长发育的影响，以明确其在白及组培生产中的应用可行性。从图2中可以看出，通过20 d培养，对照组萌发率高达95%以上，叶片舒展，根系生长明显呈白色。百菌清0.05%浓度萌发率大于90%，少量萌发后变褐死亡，叶片明显短小，根系没有或变短，根基部变褐色，表现为生长抑制，而0.1%以上浓度种子基本萌动后全部死亡，可见百菌清对白及种子萌发毒性较大。多菌灵0.05%浓度萌发率基本和对照相当，叶片舒展，根系明显，部分甚至长于对照组；0.1%浓度处理组萌发率大于90%，少量萌发后变褐死亡，叶片、根系明显缩短，根开始变褐色，表现出一定的生长抑制作用；0.2%浓度处理组萌发率大于70%，萌发后变褐死亡明显增多，叶片短小，大部分未长根，生长抑制显著；0.4%浓度处理组全部死亡。代森锰锌0.05%浓度处理组种子有萌动变绿色小球，但未见叶片根系等组织分化，部分开始变褐死亡，0.1%以上浓度全部死亡，对白及种子萌发表现为较大毒性作用。可见多菌灵对白及种子萌发毒性相对较低，结合前述各抑菌剂对白及常见污染菌株抑制活性，其较适合用于白及种子萌发添加抑菌剂，既可有效预防白及母瓶污染，又可确保种子正常萌发生长；而百菌清次之，浓度不应高于0.05%；代森锰锌毒性较大，不适合白及组培应用。

A～F分别表示空白对照、百菌清0.05%、多菌灵0.05%、多菌灵0.1%、多菌灵0.2%、代森锰锌0.05%图2 不同浓度抑菌剂对白及种子萌发的影响

2.4 农用抑菌剂对白及小苗分化、生长发育的影响

白及种子播种MS液体培养基，萌发培养30 d后转接到含系列浓度抑菌剂的MS固体培养基中继续培养2个月后统计各组白及小苗生长情况，结果如图3和表2所示。对照组植株生长分化正常，平均株高在3.76 cm，根系和叶片较多，分别为5.55条和4.00片；除了含0.05%百菌清处理组株高和根数，0.1%百菌清和0.05%代森锰锌处理组叶片数和对照组无显著差异外，其他各处理组指标均表现出不同程度的生长抑制作用。含百菌清0.2%基本停止生长分化，0.4%全部褐化死亡；多菌灵各浓度虽都有一定生长分化，但随浓度升高株高显著变矮，叶片数变少，根系停止生长；代森锰锌0.05%即对白及种子萌发完全抑制，但此浓度下白及小苗还能生长分化，但生长抑制现象明显，而0.1%以上浓度全部褐化死亡，仍然表现出较大毒性。可见百菌清对种子萌发影响较大，但对应浓度对白及小苗生长分化影响较小，而多菌灵对白及种子萌发影响相对较小，但对应浓度对白及小苗生长抑制较百菌清明显。因此，白及种子萌发母瓶适合选用多菌灵为抑菌剂，而小苗分化培养适合选用百菌清作为抑菌剂。

A～I分别表示空白对照组、百菌清0.05%、百菌清0.1%、百菌清0.2%、多菌灵0.05%、多菌灵0.1%、多菌灵0.2%、多菌灵0.4%和代森锰锌0.05%图3 各抑菌剂对白及小苗生长发育影响

组别株高/cm根数叶片数对照3.76±0.90e5.55±1.13d4.00±0.45d百菌清0.05%3.65±0.73e5.00±1.00d3.27±0.65ac百菌清0.1%2.48±0.38ab3.73±0.79a3.82±0.40d百菌清0.2%0.54±0.29f0e3.67±0.50dc多菌灵0.05%2.73±0.67a3.92±0.95a3.08±0.28abc多菌灵0.1%2.26±0.36b3.38±0.87ab3.15±0.38abc多菌灵0.2%1.59±0.39c2.58±1.08c2.92±0.29abc多菌灵0.4%1.05±0.22d2.54±0.66c2.85±0.55ab代森锰0.05%锌2.29±0.90ab2.82±0.75bc3.73±0.47d

注：不同字母表示不同处理比较具有显著性差异，P<0.05。

2.5 添加0.05%多菌灵对预防白及种子萌发污染效果

以MS为对照，配制含多菌灵0.05%的MS培养基，接种白及种子各100瓶，置于25 ℃，3 000 lx每天光照培养12 h，培养20 d后统计污染率。结果表明，未加抑菌剂的MS培养基真菌污染率达25%，附加0.05%多菌灵后污染率仅为2%，起到了很好的预防作用。

3 讨论

植物组培因其快繁、脱毒等众多优点已得到广泛应用，但同时因其设备、人员操作、管理等要求较高，生产成本仍然较高。为此，不少学者采用培养基中添加抑菌剂的方式以便降低生产成本和提高生产效率，并已取得了良好效果，也由此产生了“开放式组培”这一新方法[7]。鉴于各抑菌剂在开放式组培中的成功应用，同时立足白及组培真菌污

染严重这一现实，本文开展了常用农用真菌抑菌剂百菌清、多菌灵和代森锰锌在白及组培污染防治应用的可行性研究。从上述结果看，代森锰锌对白及组培常见污染真菌抑制效果较好，但其对白及种子萌发毒性较大，不适合做萌发抑菌添加剂，同时其对白及幼苗分化生长抑制明显，因此也不适合做继代幼苗添加剂。百菌清对白及种子萌发毒性也较大，0.1%浓度种子已全部死亡，而且0.05%浓度对白及常见真菌不能实现完全抑制，因此也不适合作为白及种子萌发抑菌添加剂。无论是对白及种子萌发还是幼苗生长分化，多菌灵均表现出较低毒性，但0.1%以上浓度生长分化抑制较为明显。因此，综合考虑0.05%多菌灵是白及种子萌发较为理想的抑菌添加剂，而且进一步试验验证其可使白及种子母瓶真菌污染率降低至2%，有效解决了白及母瓶污染这一主要问题。继代育苗培养整体污染率较低，鉴于0.05%百菌清对白及小苗生长发育影响较小，可以考虑作为继代育苗抑菌添加剂，以减少组培污染损失。此外，还应从源头把关，合理优化白及硕果采摘时间，以确保不因果荚开裂而增加污染机率。

[1] JIANG F, LI W, HUANG Y, et al. Antioxidant, antityrosinase and antitumor activity comparison: the potential utilization of fibrous root part of,Bletillastriata, (Thunb.) Reichb.f[J]. Plos One, 2013, 8(2):269-284.

[2] 刘福平.植物抗菌组培中抗菌剂应用的研究方法[J]. 基因组学与应用生物学, 2014(4):910-915.

[3] 李晓燕. 抑菌剂抑菌能力比较及其对组培苗生长发育的影响[D]. 大连：辽宁师范大学, 2007.

[4] 张薪薪. 抑菌剂筛选及对组培污染防治的初步研究[D]. 大连：辽宁师范大学, 2006.

[5] 李美芽, 吴运帷, 蒋福升,等. 一株具有抗HepG2活性的胡桃楸内生真菌的分离及研究[J]. 中国中药杂志, 2009, 34(13):1623-1627.

[6] 韦艳梅, 周雅琴, 李力,等. 白及内生真菌多样性研究[J]. 广西植物, 2016, 36(7):832-836.

[7] 曾云英. 植物开放式组织培养的研究进展及发展前景[J]. 江苏农业科学, 2015(4):11-13.

(责任编辑：张瑞麟)

2016-12-13

浙江省科技计划项目(2015C32084)；中医药行业科研专项(201507002)

赵双双(1996—)，生物科学专业，E-mail：zhaoss0814@163.com。

李美芽，E-mail: lmeiya@126.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170429