液相色谱-大气压化学电离串联质谱法测定蔬菜中百菌清残留

2021-04-30李凌云许晓敏刘广洋黄晓冬徐东辉裴志国

农产品质量与安全 2021年1期

李凌云许晓敏林桓刘广洋黄晓冬高慧徐东辉裴志国

（1.中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业农村部蔬菜质量安全控制重点实验室，农业农村部园艺作物生物学与种质创制重点实验室，北京100081； 2.岛津企业管理（中国）有限公司，北京 100020； 3.中国科学院生态环境研究中心，环境化学与生态毒理学国家重点实验室，北京100085）

百菌清（chlorothalonil，CTN）是一种高效、广谱的有机氯杀菌剂，对多种作物的真菌病害有良好的防治效果，因此在我国的蔬菜、水果、水稻等作物生产中应用非常广泛[1]。由于百菌清在植物上的黏着性较强，不易被雨水冲刷，难以降解且药效期较长等特点[2]，极易在蔬菜和水果中残留，从而对农产品的质量安全造成影响。大量的研究表明，百菌清对鱼类和水生无脊椎动物具有明显的毒性，其中许多鱼类的 96 h 半致死量（LC50）为 10～195 μg/L[3]。除此之外，人们还发现长期低剂量的百菌清暴露甚至可以抑制青春期小鼠卵巢的发育[4]。因此对蔬菜和水果中残留的百菌清进行快速准确的测定，对于保障人们的餐桌安全至关重要。目前报道的检测百菌清的方法主要有液相色谱法[5～6]，气相色谱法[7～9]，气相色谱-质谱联用法[10～11]。但这些检测方法的样品前处理过程繁琐，不但需要SPE柱净化，且耗时较长。而液相色谱-串联质谱技术因具有抗干扰能力强、选择性好、灵敏度高等优点，已成为农药残留检测的首选方法[12～15]。但百菌清的分子结构（见图1）中包含一个苯环和与苯环连接的4 个氯原子和2 个氰基，这样的结构特点决定了它在常见的电喷雾离子源（ESI）中很难电离，因此，目前液相色谱-串联质谱检测百菌清的研究在国内还未见报道。本研究采用APCI 对百菌清进行分析，建立了负离子MRM 模式的检测方法，并将该方法应用于蔬菜中百菌清残留的测定。

一、实验部分

（一）仪器、试剂与材料LC-30A 超高效液相色谱仪和LC-MS/MS-8050 三重四极杆质谱仪均购自日本Shimadzu 公司。

乙腈、甲醇（HPLC 级，美国 JT Baker 公司）；乙酸铵（HPLC 级，美国 Fluka 公司）；水（超纯水，Milli-Q 超纯水仪制备）；百菌清 1 000 mg/L标准溶液购自农业农村部环境保护科研监测所；其他试剂均为分析纯，购自北京化学试剂公司。

番茄、西葫芦、芹菜、大白菜、花椰菜、结球甘蓝分别代表茄果类、瓜类、叶菜类、白菜类和甘蓝类等不同类型蔬菜。

（二）样品处理称取10.0 g 均质后蔬菜试样于 50.0 mL 离心管中，加入 20.0 mL 乙腈，振荡提取 30 min 后（300 r/min），加入 5.0 g 氯化钠，手动剧烈振摇 1 min，以 5 000 r/min 离心 3 min 后，取上层乙腈相，过 0.22 μm 滤膜，滤液供分析。

（三）仪器条件色谱柱： Phenomenex Kinetex C18 （50 mm ×3 mm，2.6 μm）；流动相： A 相为甲醇； B 相为乙酸铵（1.0 mmol/L）水溶液；梯度洗脱条件： 0min，20%A； 0 ～5 min，20%～95%A；5 ～7 min，95%A； 7 ～7.1 min，95% ～20%A；7.1～12 min，20%A；流速为 0.3 mL/min；柱温为40℃；进样量为 1 μL。

APCI 离子源；负离子扫描； MRM 监测模式；电晕针电压3 500 V；雾化气流量3 L/min，干燥气流量5 L/min，以上2 种气体均为氮气；接口温度350℃；脱溶剂管温度 200℃；加热模块温度200℃；碰撞气压力 2.7×105Pa，该气体为氩气。

二、结果与讨论

（一）质谱条件的优化在APCI 源负离子模式下，对百菌清的一级质谱进行扫描（见图2），结果只检测到一个离子m/z245。根据同位素比例3∶3∶1，推测该离子m/z245 为 4-羟基百菌清[C8N2OCl3]-。它可能是百菌清在离子源中发生水解反应，4 号位的氯原子被羟基取代所致（见图1）。为了验证该结论的正确性，实验比较了该离子m/z245 与4-羟基百菌清母离子[M-H]-的二级谱图（见图3），结果表明，在相同的碰撞能量下，两者均得到 4 个碎片离子峰m/z147、175、182 和 210，且碎片离子峰的丰度比基本一致。因此百菌清一级谱中的离子峰m/z245 即是4-羟基百菌清的质谱峰。本实验以m/z245 作为百菌清的母离子，对其二级质谱进行分析，并选取丰度较高，干扰较小的两对子离子m/z175、182 为定性离子，对四极杆预杆偏置电压（Q1 Pre Bias 和 Q3 Pre Bias）、碰撞能量（CE）等进行优化，优化的质谱参数见表1。百菌清的质谱参数同样也可以检测4-羟基百菌清，但两个化合物的保留时间是不同的（见图4）。

图1 百菌清及其母离子的分子结构式

图2 百菌清的一级全扫描质谱图

图 3 百菌清（A）和 4-羟基百菌清（B）的二级谱图

表1 百菌清的监测离子对及质谱参数

（二）流动相的优化考察了甲醇/ 水、乙腈/水、甲醇/ 乙酸铵溶液为流动相时对百菌清色谱行为的影响。结果显示，利用甲醇/ 水做流动相时，百菌清的响应值好于乙腈/ 水做流动相，因此本实验选择甲醇做有机相。另外，当在甲醇/ 水溶液中加入1.0 mmol/L 浓度的乙酸铵时，百菌清的响应有所提高，进一步增加乙酸铵的浓度（2.5、5.0、10.0 mmol/L）对百菌清的响应影响不大。综合考虑，本实验选取甲醇/1.0 mmol/L 乙酸铵溶液做为最终的流动相。优化条件下百菌清的色谱图见图4。

图 4 4-羟基百菌清（1）和百菌清（2）标准溶液（0.1 mg/L）的MRM 色谱图

（三）基质效应考察在质谱分析中，基质中共提取的干扰物质会影响目标化合物的离子化，从而增强或抑制化合物在仪器上的响应，这些影响和干扰被称为基质效应。由于基质效应会影响分析方法的准确度，因此必须对基质效应进行考察。本文采用标准曲线法评价基质效应。分别用溶剂和空白基质溶液配制系列标准溶液，绘制标准曲线。

公式（1）[17]中，k1为溶剂标准曲线的斜率，k2为基质匹配标准曲线的斜率。ME为正数表示基质增强效应，为负数表示基质抑制效应。|ME| 在0～20%时，为弱基质效应，在20%～50%时为中等基质效应，＞50%时为强基质效应。结果如图5所示，百菌清在各蔬菜中均表现为基质增强效应，即基质的存在，有助于百菌清在离子源发生脱氯水解反应，从而使百菌清的信号增强。在5 种蔬菜中，番茄的基质效应（22.1%）最小，属于中等基质效应。大白菜和西葫芦中百菌清虽也表现为中等基质效应，但它们的基质效应较番茄高很多，分别为49.2%和47.4%。在芹菜和花椰菜中百菌清表现为强基质效应，分别为59.4%和59.5%。由于百菌清在各种蔬菜中的基质增强效应明显，为了更好地消除基质效应的影响，本实验采用空白基质配制标准溶液对百菌清进行定量，以确保检测结果的准确可靠。

图5 百菌清在5 种蔬菜中的基质效应

（四）线性范围、线性关系和定量限用番茄、芹菜、花椰菜、西葫芦和大白菜的空白基质溶液，分别配制质量浓度为 0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.25 和 0.5 mg/L 的百菌清标准溶液，按上文检测方法进行分析，以色谱峰面积（y）对其质量浓度（x，mg/L）绘制标准工作曲线（见表 2）。结果显示，在 1～500 μg/L 范围内，百菌清线性关系良好，相关系数（r）为 0.998 7～0.999 8。

表2 百菌清在不同基质中的线性范围、线性方程和相关系数

方法定量限（LOQ）通过加标回收进行确定。符合一定正确度和精密度要求的最低加标浓度为定量限。百菌清在番茄、芹菜、大白菜和西葫芦4 种蔬菜中的定量限均为0.01 mg/kg。在该浓度水平下，百菌清的平均回收率为67.0%～92.6%，RSD为4.6%～13.4%，回收率和精密度数据同时满足农业部2386 号公告《农药残留检测方法国家标准编制指南》的要求。

（五）回收率与精密度在空白番茄、芹菜、花椰菜、西葫芦、大白菜和结球甘蓝样品中，分别添加0.01、0.1 和0.5 mg/kg 3 个浓度水平的百菌清进行添加回收试验，每个浓度水平平行测试6 次。百菌清在5 种蔬菜基质中的平均加标回收率和精密度结果见表3，可以看出，蔬菜基质种类明显影响百菌清的回收率。在番茄、芹菜、西葫芦和大白菜4 种蔬菜基质中，百菌清的平均回收率为67.0%～104%，RSD 为1.4%～13.4%。方法的正确度和精密度均符合农药残留分析的要求。但在甘蓝类蔬菜中，百菌清的回收率明显偏低。如在花椰菜中，3个浓度水平下百菌清的平均回收率分别为40.9%、44.0%和41.4%，而在结球甘蓝中百菌清的回收率则为0。因此本研究推测可能是甘蓝类蔬菜中的某些物质与百菌清发生了降解反应，从而导致百菌清的回收率偏低。在近来的研究中，王禹等[18]发现甘蓝叶片水提取液可以明显加快百菌清的光降解速率，他们推测可能是水提液中酚类和黄酮类物质的存在导致了百菌清的降解。而LV 等[19]则发现原花青素可以作为光敏化剂，直接促进水中百菌清的降解。但对于本研究而言，前处理过程是在室内完成，并没有紫外照射，因此甘蓝类蔬菜中具体什么物质导致了百菌清降解，还有待进一步研究。