黄芪提取物对老年痴呆大鼠NF-κB和IκB-a蛋白表达的影响

单铁强，单铁英，高立威，董 洋，郑秀清，董 静，郑海萍，王雪丹，苏安英

黄芪提取物对老年痴呆大鼠NF-κB和IκB-a蛋白表达的影响

单铁强1，单铁英2，高立威3，董 洋3，郑秀清4，董 静4，郑海萍2，王雪丹2，苏安英2

目的 研究黄芪提取物(EA)对老年性痴呆(AD)大鼠核转录因子-κB(NF-κB)和NF-κB抑制蛋白(IκB-a)蛋白的影响。方法 大鼠海马内注射Aβ25-35制备AD大鼠模型，实验分4组：对照组、模型组、黄芪组和西药治疗组。黄芪组和西药治疗组分别用黄芪提取物和脑复康灌胃，对照组和模型组用等量生理盐水灌胃。用Morris水迷宫测定各组大鼠的学习记忆能力，Western blot测定各组大鼠海马NF-κB、IκB-a和caspase-3蛋白表达水平。结果 模型组的逃避潜伏期延长，单位时间内跨越原平台次数减少，NF-κB和caspase-3蛋白表达升高，而IκB-a蛋白表达降低，与对照组比较均有统计学差异(P<0.01)；黄芪组的逃避潜伏期缩短，单位时间内跨越原平台次数增多，NF-κB和caspase-3蛋白表达降低，而IκB-a蛋白表达升高，与模型组比较均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，其作用效果与西药治疗组相当(P>0.05)。 结论 黄芪提取物通过提高AD大鼠海马区IκB-a的含量，使游离NF-κB的含量减少，激活caspase-3受到抑制，从而抑制了神经细胞的凋亡。

阿尔茨海默病；黄芪提取物；核转录因子-κB；NF-κB抑制蛋白；caspase-3

老年性痴呆又称阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，是一种进行性中枢神经系统功能退行性疾病，也是中老年人常见的一种疾病，病人常表现为认知障碍、智力减退和人格改变，如果得不到有效治疗，最终会引起多种并发症导致死亡。目前其发病机制尚不清楚，也无治疗本病的特效药。本研究采用大鼠双侧海马注射β-淀粉样蛋白25-35 (β-amyloid protein25-35，Aβ25-35)建立AD模型，主要探讨黄芪提取物(extract of astragalus，EA) 对AD大鼠学习记忆力的影响，检测大鼠海马区核转录因子-κB (nuekear factor kappa B，NF-κB)、NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB-a)和caspase-3蛋白的表达水平，分析EA对AD的学习记忆改善情况，为临床上预防和治疗AD提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠购自河北医科大学动物实验中心，雄性，月龄为11个月～13个月，体重为359.6 g±16.3 g，共30只。

1.2 仪器与试剂 脑立体定向仪：江湾Ⅰ型C，上海川沙花木农机厂制造。EA购自合肥市恒星药物研究所，先用少量<0.2%无水乙醇溶解，再加适量双蒸水，高压灭菌，4 ℃备用。

Aβ25-35购自美国Sigma公司，加入适量无菌生理盐水，配制其浓度为10 g/L，在37 ℃条件下孵育72 h，呈聚集状态，4 ℃备用。NF-κB、IκB-a和caspase-3抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 实验分组与AD模型的建立 将大鼠随机分为4组：对照组、模型组、黄芪组和西药治疗组，每组10只。参照张佳等[1]的方法建立大鼠AD模型，模型组和黄芪组均于双侧海马CA1区注射Aβ25-35各1 mL(10 mg)，正常对照组则注射等量的生理盐水。首先，在AD模型建立后的第2天，各组大鼠分别用Morris水迷宫进行测试，以确定AD模型的建立是否成功。然后，黄芪组用EA灌胃，剂量为80 mg/(kg·d)，西药治疗组用吡拉西坦(脑复康)灌胃，剂量为430 mg/(kg·d)，模型组和对照组给予等量生理盐水。治疗时间为18 d。在第19天时，再进行一次时间为5 d的Morris水迷宫测试，次日杀死大鼠取出各组的海马组织用于Western blot检测。

1.4 Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力 水迷宫为黑色内壁的圆形水池，直径120 cm，高55 cm，水深42 cm，距池壁35 cm处放置一圆形站台，直径8 cm，高40 cm。实验共5 d，前1 d先进行2 min的自由游泳以适应环境，以后每天在上午和下午各训练一段，每段3次，连续训练4 d。训练时把大鼠面向池壁随机放入一个入水点开始计时，在120 s内找到站台的时间作为潜伏期；若在120 s内未找到站台则将其引至站台，潜伏期记为120 s。在第5天进行定位航行实验，观察并记录其上站台的潜伏期。

上述实验完成后，大鼠休息3 h，撤去站台，把大鼠面向池壁在同一入水点放入水中，记录其在120 s内穿越站台相应位置的次数。

1.5 Western blot检测NF-κB、IκB-a和caspase-3蛋白的表达水平 用上样缓冲液5×SDS与各组大鼠海马组织总蛋白提取物50 μg均匀混合，100 ℃煮沸5 min，冰上冷却，加入PAGE凝胶孔内，进行恒压为120 V电泳。在77 V恒压和185 mA的条件下分别用45 min将凝胶上蛋白转移至PVDF膜，用TTBS 20 mL和1 g奶粉封闭2 h。将膜分别浸入兔抗鼠多克隆抗体NF-κB(1∶250)、IκB-a(1∶300)和caspase-3(1∶250)溶液，4 ℃孵育过夜。TTBS溶液洗膜3次，每次10 min，将膜浸入辣根过氧化物酶标记的二抗溶液(1∶10 000)，37 ℃孵育2 h，TTBS溶液洗膜3次，每次10 min，化学发光法显色。

2 结 果

2.1 EA对大鼠学习记忆能力的影响 大鼠模型建立后，在未进行任何处理之前4组模型大鼠进行Morris水迷宫实验的结果显示：模型组、黄芪组和西药治疗组的逃避潜伏期均明显高于对照组，而穿台次数均明显低于对照组(见表1)，表明AD模型建立成功。定位航行实验：随着训练天数的增加，各组寻找站台的潜伏期越来越短，表明4组大鼠通过学习，均可对水下的站台产生空间定位记忆。在训练第1天～第4天，模型组大鼠的平均潜伏期明显大于对照组(P<0.05)；与模型组比较，黄芪组的潜伏期在训练第3天～第4天均显著缩短，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，黄芪组与西药治疗组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

空间探索实验：与对照组相比，模型组大鼠穿越站台次数明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，黄芪组大鼠穿越站台次数明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)，黄芪组与西药治疗组相比差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表1 各组大鼠学习记忆行为比较(±s)

表2 EA对大鼠学习记忆能力的影响(±s)

2.2 EA物对大鼠海马NF-κB、IκB-a和caspase-3蛋白表达的影响 Western blot显示：模型组NF-κB和caspase-3蛋白表达升高，而IκB-a蛋白表达降低，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；黄芪组NF-κB和caspase-3蛋白表达降低，而IκB-a蛋白表达升高，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见图1、表3。

图1 Western blot检测海马组织NF-κB、IκB-a 和caspase-3蛋白表达(n=10)

表3 大鼠海马组织NF-κB、IκB-a和 caspase-3蛋白表达(±s)

3 讨 论

AD的学习和记忆能力减退。Morris水迷宫能够检测脑的学习记忆功能，成为诊断和评价AD的重要手段。本研究的水迷宫实验结果显示，与对照组相比，模型组的定位航行潜伏期显著延长，说明Aβ25-35具有神经毒性，造成大鼠学习记忆障碍，经过EA治疗后，AD大鼠学习记忆能力得到了明显提高。

AD中神经细胞的死亡以凋亡为主。NF-κB是细胞凋亡信号通路中一个重要的转录调节因子[2-3]。研究表明在AD病人脑组织中退变的神经细胞和星形胶质细胞以及早期老年斑周围的神经细胞中NF-κB被激活[4-5]，可以推测β-淀粉样蛋白可能是NF-κB的强激化剂。IκB可以和NF-κB结合形成复合物，抑制NF-κB进入细胞核，在细胞处于静息状态时，此复合体无活性，当外界信号刺激细胞后，激活IκB激酶复合体(IκB kinase，IKK)，使IκB磷酸化，NF-κB成为游离状态进入细胞核内，结合特异性基因序列并诱导其转录。caspase-3参与神经细胞的凋亡过程，作为一种剪切酶，使DNA酶激活裂解DNA，最终导致细胞凋亡[6-7]。

本实验的结果表明：模型组大鼠海马组织IκB-a的表达显著减少，caspase-3的表达明显增加，提示在AD大鼠脑组织中，IκB激酶复合体激活从而使IκB磷酸化，IκB-a与NF-κB分离，磷酸化IκB被降解，造成IκB-a的含量减少；NF-κB成为游离状态并进入细胞核内，激活了caspase-3的转录，使caspase-3表达水平明显升高。经EA治疗后AD大鼠海马区IκB-a的表达水平明显升高，而caspase-3表达水平明显降低，说明EA通过提高AD大鼠脑内IκB-a的含量，使NF-κB与IκB-a结合，抑制NF-κB进入细胞核内，不能使caspase-3的转录激活，从而降低了caspase-3表达水平，抑制了神经细胞的凋亡。

综合上述，EA可能使神经细胞中IκB-a的蛋白表达水平升高，增加NF-κB与IκB-a的结合，使游离状态的NF-κB减少，抑制其进入细胞核激活caspase-3的转录，阻止了其下游caspase-8、caspase-9的活化，从而抑制神经细胞的凋亡。但是EA是如何提高神经细胞中IκB-a的表达水平，其机制还不清楚，尚需进一步的研究。

[1] 张佳，宋立刚，孔卫娜，等.红景天苷对Aβ1-40所致阿尔茨海默病模型大鼠认知功能改善作用及机制探讨[J].中国中药杂志，2012，37(14)：2122-2126.

[2] 姜波.补阳还五汤胶囊对AD大鼠NF-κB信号调控及对觅形胶质细胞相关蛋白表达影响的实验研究[D].哈尔滨：黑龙江中医药大学，2010.

[3] 姚丽芬.Aβ1-40诱导痴呆大鼠脑海马及皮质基因表达谱差异的实验研究[D].长春：吉林大学，2005.

[4] 孙建英，关新华，张秀清，等.两种给药途径致痫大鼠海马神经元超微结构损伤及caspase3的表达特征[J].神经解剖学杂志，2007，23 (6)：565-570.

[5] O’Neill LAJ，Kaltschmidt C.NF-κB：a crucial transcription factor for glial and neuronal cell function[J].Trends Neurosci，1997，20：252-258.

[6] 刘萍，丛国止，独军政，等.细胞凋亡信号传导通路的研究进究[J].湖北农业科学，2010，49(3)：715-717.

[7] Choi JY，Kim BM，Kim YJ，et al.Hypoxia/reoxygenation-induced cytotoxicity in cultured human lymphocytes [J].Biochem Biophys Res Commun，2007，352(2)：366-371.

(本文编辑郭怀印)

The Influence of Astragalus Extract on the Protein Expression of NF-κB and IκB-a in Rats with Alzheimer’s Disease

Shan Tieqiang，Shan Tieying，Gao Liwei，Dong Yang，Zheng Xiuqing，Dong Jing，Zheng Haiping，Wang Xuedan，Su Anying

Harbor Hospital of Qinhuangdao，Qinhuangdao 066000，Hebei，China

Objective To study the effects of astragalus extract(EA) on the protein expression of nuclear factor-κB (NF-κB) and IκB-a in rats with Alzheimer’s disease (AD).Methods The AD model rats were established by injecting Aβ25-35 into districts of hippocampuses.The rats were divided into 4 groups：control group，model group，EA group，piracetam group.The rats in EA group and piracetam group were treated with EA and piracetam lavage respectively，with isodose physiological saline lavage in control group and model group.The ability of learning and memory was detected by Morris water maze.The protein expression level of NF-κB，IκB-a and caspase-3 in the hippocampus was detected by western blot.Results Compared with control group，the incubation period of avoiding was lengthened，the frequency of passing through platform was decreased，the expression level of NF-κB and caspase-3 was increased，while the expression level of IκB-a was decreased in model group(P<0.05).Compared with the model group，the incubation period of avoiding was obviously shorten，the frequency of passing through platform was increase，the expression level of NF-κB and caspase-3 was decreased，while the expression level of IκB-a was increased in EA group (P<0.05 or P<0.01).Its effect was similar with western medicine treatment group (P>0.05).Conclusion EA can increase the content of IκB-a and decrease the content of free NF-κB in the hippocampus of AD rat，and restrained the activation of caspase-3，inhibit the apoptosis of nerve cells.

astragalus extract；Alzheimer’s disease；nuclear factor-kB；IκB-a；caspase-3

1.河北省秦皇岛市海港医院(河北秦皇岛 066000)，E-mail：sty751218@163.com；2.河北工程大学；3.河北省邯郸市中心医院；4.河北省邯郸市疾病预防控制中心

引用信息：单铁强，单铁英，高立威，等.黄芪提取物对老年痴呆大鼠NF-κB和IκB-a蛋白表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(7)：802-804.

R743 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.07.010

1672-1349(2017)07-0802-03

2016-11-11)