超临界CO2萃取烟花中西柏三烯二醇工艺研究

何 康，张怀宝，杜咏梅，刘新民，蒯 雁，付秋娟



超临界CO2萃取烟花中西柏三烯二醇工艺研究

何 康1,2，张怀宝1*，杜咏梅1，刘新民1，蒯 雁3，付秋娟1

（1.中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京100081；3.大理州烟草公司南涧县分公司，云南大理671000）

为了建立超临界CO2萃取烟花中的西柏三烯二醇的最佳工艺条件，以烟花为原料，通过单因素试验，考察了萃取时间、萃取温度、萃取压力和夹带剂流速对西柏三烯二醇提取量的影响，在此基础上以上述4个因素为变量，以西柏三烯二醇提取量为响应值进行中心复合设计（central composite design），对其提取工艺条件进行优化。结果表明，萃取时间120 min、萃取温度42 ℃、萃取压力13.9 MPa、夹带剂乙醇流速0.67 g/min为最优提取工艺条件。在该条件下，由响应面模型预测的西柏三烯二醇提取量为6.065 mg/g。本试验西柏三烯二醇的实际提取量为5.978 mg/g，提取率为97.1%。说明central composite design结合响应面分析法能够实现对烟草中西柏三烯二醇的低污染高效提取。

烟草；西柏三烯二醇；超临界CO2萃取；中心复合设计

类西柏烷化合物是一类含有十四元大环的双萜类天然产物，分子结构较为复杂，主要存在于烟草表皮的腺毛分泌物中[1-2]，同时也存在于少数海洋生物[3]和动物[4-5]中。烟草中已分离获得50多种类西柏烷化合物，其中西柏三烯二醇是烟草中主要的的西柏烷化合物[6-7]。研究表明，烟草中的西柏三烯二醇可通过降解产生茄酮、茄呢呋喃、降茄二酮等香味成分，茄酮、茄呢呋喃、降茄二酮是烟草香气成分的重要贡献者[8-9]。SEVERSON等[10]将含有α和β西柏三烯二醇的混合物注射到标准卷烟中，评吸结果表明，经处理后卷烟具有可可香味，且余味干净，吃味丰满，具有花香韵或粉香韵。日本烟草公司曾将从东方烟花蕾中经溶剂萃取得到的西柏三烯二醇配成0.01%乙醇溶液喷洒于烟叶上，可大大改善烟草的香味。以上表明，西柏三烯二醇对于烟草香味的产生具有非常重要的作用，对于提高烟叶品质和使用价值、提升卷烟香气、凸显卷烟特色方面具有重大价值。

目前对烟草中西柏三烯二醇的提取方法采取的仍是传统的有机溶剂提取法，即有机溶剂浸提、浓缩获得烟草西柏三烯二醇粗浸膏[11]，这种提取技术以烟草叶片作为原料，存在着浪费烟草原料的问题，而且提取物中还会有溶剂残留，增加外来化学物质给卷烟安全带来的潜在性风险。中国农业科学院烟草研究所发明了一种从烟草花序中提取西柏三烯二醇的方法[12]，解决了烟草原料浪费的问题，但提取物中仍会有溶剂残留。基于西柏三烯二醇在卷烟增香方面的应用潜力，为了克服以上提取方法的不足，本研究选取超临界CO2萃取技术，并以乙醇作为夹带剂[13-14]，对西柏三烯二醇进行提取。其原理是当CO2处在临界温度和临界压力以上时，可以被用作溶剂，提取完成之后又易与目标物分离，相较于传统工艺能对西柏三烯二醇进行无污染的直接提取[15-18]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：SFE-500M-2BASE超临界CO2萃取装置（美国Waters公司）；BSA124S-CW电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪（美国Waters公司）。

试剂：乙酸乙酯、乙醇为均分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；乙腈为色谱纯（德国MERCK公司）；CO2气体（纯度99.99％，青岛德海伟业科技有限公司）。

1.2 材料预处理

将烟花（品种为NC55，由山东省诸城市辛兴试验站提供）于阴凉处晾干，测定含水率为13%，切丝混匀，作为超临界CO2萃取的原料。另取部分样品于60 ℃烘干，制成40目粉末，4 ℃冰箱中贮存，用于原料中西柏三烯二醇含量的测定。

1.3 色谱分析条件

色谱条件：流动相70%的乙腈等梯度洗脱；色谱柱BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流速0.3 mL/min；进样量3 μL；柱温35 ℃；检测波长200 nm。

1.4 试验方法

1.4.1 样品中西柏三烯二醇含量的测定 称取0.1 g粉末置于试管中，加入5 mL乙酸乙酯，混匀，40 ℃超声提取10 min，离心，取上清液放入25 mL容量瓶中；残渣继续按照以上步骤提取2次，时间为10 min，3次提取液合并，以乙酸乙酯定容至25 mL，取2 mL该溶液置于试管中，经氮气吹干后，加2 mL 95%乙腈溶解，采用高效液相色谱法测定样品中的西柏三烯二醇含量，外标法定量，以10次重复测定结果的平均值作为样品中西柏三烯二醇含量。

1.4.2 单因素试验 准确称取10 g样品，加入萃取釜中，固定CO2流速为20 g/min，夹带剂为乙醇，设置初始萃取压力12.5 MPa，萃取温度40 ℃，萃取时间60 min，夹带剂流速0.8 g/min，分别考察萃取温度（30、35、40、45、50 ℃）、压力（7.5、10、12.5、15、17.5 MPa）、时间（30、60、90、120、150 min）、夹带剂流速（0.2、0.5、0.8、1.1、1.4 g/min）对西柏三烯二醇提取量的影响。

1.4.3 Central Composite试验设计 根据Central Composite试验设计原理，综合单因素试验结果，选取萃取时间、萃取温度、萃取压力和夹带剂流速对西柏三烯二醇提取影响显著的4个因素，分别以、、和代表，每一个自变量的不同试验水平分别以-2、-1、0、1、2进行编码，如表1所示。

表1 西柏三烯二醇提取响应面分析因素与水平

2 结 果

2.1 影响西柏三烯二醇提取量的因素

2.1.1 萃取温度对西柏三烯二醇提取量的影响 在预试验中，发现CO2流速对西柏三烯二醇提取率的影响较小，考虑到设备的承受能力与节约资源，固定CO2流速为20 g/min，选用乙醇作为夹带剂，设置其他萃取条件为：萃取压力12.5 MPa，萃取时间60 min，夹带剂流速0.8 g/min。图1表明，在其他条件不变情况下，温度在30~50 ℃范围内增加时，西柏三烯二醇提取量先升高后降低，在40 ℃时提取量达到最大值。所以，选取最佳萃取温度为40 ℃，此时西柏三烯二醇提取量为5.456 mg/g，提取率为88.6%。

图1 萃取温度对西柏三烯二醇提取量的影响

2.1.2 萃取压力对西柏三烯二醇提取量的影响 图2表明，在固定萃取条件为萃取温度40 ℃，萃取时间60 min，夹带剂流速0.8 g/min情况下，压力在7.5～17.5 MPa范围内增加时，西柏三烯二醇提取量呈先升高后降低的趋势，在12.5 MPa时西柏三烯二醇的提取量达到最高。因此，超临界CO2萃取西柏三烯二醇较好的萃取压力为12.5 MPa，此时西柏三烯二醇提取量为5.48 mg/g，提取率为88.9%。

2.1.3 夹带剂流速对西柏三烯二醇提取量的影响 图3表明，在固定萃取条件为萃取压力12.5 MPa，萃取温度40 ℃，萃取时间60 min情况下，夹带剂流速在0.2~1.4 g/min范围内增加时，西柏三烯二醇提取量随夹带剂流速的增加呈先升后降的趋势，当夹带剂流速上升到0.8 g/min时提取量达到最大。因此，超临界CO2萃取西柏三烯二醇较好的夹带剂流速为0.8 g/min，此时西柏三烯二醇提取量为5.51 mg/g，提取率为89.5%。

2.1.4 萃取时间对西柏三烯二醇提取量的影响 图4表明，在固定萃取条件为萃取压力12.5 MPa，萃取温度40 ℃，夹带剂流速0.8 g/min情况下，时间在30~90 min范围内增加时，烟草西柏三烯二醇提取量随时间的延长而升高，到90 min时接近最大值，之后再随着时间延长，西柏三烯二醇提取率虽略有上升，但差异不显著，从节约资源，控制成本，提高效率等方面考虑，选择萃取时间为90 min，此时西柏三烯二醇提取量为5.7 mg/g，提取率为92.5%。

图2 萃取压力对西柏三烯二醇提取量的影响

图3 夹带剂流速对西柏三烯二醇提取量的影响

图4 萃取时间对西柏三烯二醇提取量的影响

2.2 响应面分析法优化烟草西柏三烯二醇萃取工艺条件

2.2.1 模型方程的建立与显著性检验 利用Design Expert软件，通过表2中西柏三烯二醇试验数据进行多元回归拟合，获得西柏三烯二醇对编码自变量萃取温度、萃取压力、萃取时间和夹带剂流速的回归方程：=5.76+0.17+0.31+ 0.22-0.17+0.10-0.071-0.088-0.023- 0.0088+9.50×103-0.222-0.312-0.0432- 0.242。由表3可知，整体模型的＜0.0001，表明该二次方程模型高度显著。通过回归方差分析，该模型回归显著（＜0.0001），失拟项=0.0892＞0.05不显著，并且该模型的2＝0.9393，说明该模型与实际实验拟合较好，能解释93.9%响应值的变化，可以用于西柏三烯二醇提取量的理论预测。通过软件Design-Expert 8.05求解方程，得出了最优提取工艺条件为：萃取时间120 min、萃取温度42.23 ℃、萃取压力13.85 MPa，夹带剂流速0.67 g/min。在该条件下由响应面模型预测的西柏三烯二醇提取量为6.065 mg/g。考虑到实际操作的可行性并取得最佳效果的目的，将西柏三烯二醇的提取工艺条件修正为：萃取时间120 min、萃取温度42 ℃、萃取压力13.9 MPa，夹带剂流速0.67 g/min。

2.2.2 因素间的交互影响 图5~9中左侧等高线图形均为椭圆形，表面萃取温度和夹带剂流速、萃取温度和萃取压力、萃取温度和萃取时间、萃取时间和夹带剂流速、萃取压力和萃取时间的交互作用对西柏三烯二醇的提取量影响均显著。图10中左侧等高线图形趋于圆形，表明萃取压力和夹带剂流速两因素交互作用不显著。从图5中右侧响应面立体图看出，随着夹带剂流速和萃取温度的升高，西柏三烯二醇提取量呈先升高后降低的趋势，但西柏三烯二醇提取量沿萃取温度方向增加速率较快，沿夹带剂流速方向增加速率较慢，说明西柏三烯二醇提取量受萃取温度的影响较显著。图9中右侧响应面立体图可以看出，随着萃取时间的延长，西柏三烯二醇提取量不断上升，上升速率减缓。随着萃取压力的增大西柏三烯二醇提取量呈先上升后下降的趋势，但西柏三烯二醇提取量沿萃取压力方向增加速率较大，沿提取时间方向增加速率较小，说明西柏三烯二醇提取量受萃取压力的影响较显著。

表2 西柏三烯二醇提取响应面分析方案及结果

表3 回归模型方程的方差分析

注：**极显著（＜0.01）；*显著（＜0.05）。

2.2.3 结果验证 为检验结果的可靠性，采用优化得出的工艺条件进行3次验证试验，结果得出西柏三烯二醇的实际提取量为5.98 mg/g，与理论预测值相比相对偏差为1.43%，说明该方程与实际情况较相符，验证了响应面模型的正确性，提取出的西柏三烯二醇纯度达到21.4%，较传统提取方法有较大提高。与1.4.1中测得的样品中西柏三烯二醇含量比较，提取率为97.1%，所以，此条件下基本上能把样品中的西柏三烯二醇提取完全。

图5 萃取温度和夹带剂流速对西柏三烯二醇提取量的等高线（左）和响应面（右）

图6 萃取温度和萃取压力对西柏三烯二醇提取量的等高线（左）和响应面（右）

图7 萃取温度和萃取时间对西柏三烯二醇提取量的等高线（左）和响应面（右）

图8 萃取时间和夹带剂流速对西柏三烯二醇提取量的等高线（左）和响应面（右）

图9 萃取压力和萃取时间对西柏三烯二醇提取量的等高线（左）和响应面（右）

图10 萃取压力和夹带剂流速对西柏三烯二醇提取量的等高线（左）和响应面（右）

3 讨 论

本研究首次采用超临界CO2萃取技术对烟花中的西柏三烯二醇进行萃取，在单因素试验的基础上，采用4因素5水平的响应面分析法优化西柏三烯二醇的提取工艺，得到最佳的提取工艺条件为：萃取时间120 min、萃取温度42 ℃、萃取压力13.9 MPa、夹带剂乙醇流速0.67 g/min。试验所用原料为烟花，解决了传统提取方法[11-12]浪费烟叶问题，也为烟草废弃物的再利用探索到一条新途径。本研究选用夹带剂为乙醇，与孙文梁等[11]、何峰等[19]采用的传统的有机溶剂提取试验方法进行比较，实现了对烟草中的西柏三烯二醇的产物安全、低污染提取。卷烟企业每年都会报废大量的不适用烟叶，其燃烧或掩埋处理会造成资源的浪费和环境污染。下一步将加强对工业卷烟可用性差的低次烟叶和废弃烟叶进行西柏三烯二醇提取的研究，以丰富西柏三烯二醇的开发利用资源。

4 结 论

本研究建立了一种超临界CO2萃取烟花中西柏三烯二醇的工艺方法。并采用Design-Expert软件的中心复合设计方法设计响应面试验。结合响应面交互作用分析结果和实际情况预测最佳条件，并验证后得出西柏三烯二醇最佳提取条件：萃取时间120 min、萃取温度42 ℃、萃取压力13.9 MPa，夹带剂流速0.67 g/min。在优化得到的最佳提取条件下进行提取，得到的西柏三烯二醇提取量为5.978 mg/g，提取率是97.1%，利用响应面分析法得到的西柏三烯二醇提取工艺参数真实可靠，提取效率高。

[1] 李玉芬，梁林富，萧伟，等. 肉芝软珊瑚属中二聚西柏三烯二醇化合物的化学和生物活性研究进展[J]. 有机化学，2013，33（6）：1157-1166.

[2] 任晋，苏亚伦. 西松烷型大环二萜类化合物研究进展[J]. 中草药，2014，45（20）：2997-3008.

[3] 李国强，张艳玲，林文翰. 西松烷二萜类海洋活性成分研究进展[J]. 中国海洋大学学报（自然科学版），2006，36（3）：370．

[4] PUPO M T, ADORNO M A T, VIEIRA P C, et al. Terpenoids and Steroids from Trichilia Species[J]. Journal of the Brazilian Chemical Society, 2002, 13(3): 382-388.

[5] MATTERN D L, SCOTT W D, MCDANIEL C A, et al. Cembrene A and a Congeneric Ketone Isolated from the Paracloacal Glands of the Chinese Alligator (Alligator sinensis)[J]. Journal of Natural Products, 1997, 60(8): 828-831.

[6] YAN N, DU Y M, LIU X, et al. Chemical structures, biosynthesis, bioactivities, biocatalysis and semisynthesis of tobacco cembranoids: An overview[J]. Industrial Crops & Products, 2016, 83: 66-80.

[7] 史宏志. 烟草香味学[M]. 北京：中国农业出版社，2011：202-203.

[8] 郑庆霞，马国需，翟妞，等. 烟叶中1个新的开环西松烷二萜类化合物[J]. 中草药，2015，46（14）：2040-2044.

[9] 贾春晓，何峰，马宇平，等. 西柏烯类化合物研究进展[J]. 郑州轻工业学院学报（自然科学版），2016（1）：46-54.

[10] SEVERSON R F.The cuticular chemistry of[C]. Paris: CORESTA, 1990: 34-54.

[11] 孙文梁，高伟. 一种分离纯化烟草中两种致香前体物的方法：CN102206138A[P]. 2011-10-05.

[12] 张忠锋，杜咏梅，颜培真，等. 烟草花序中提取西柏烷二萜的方法：CN105001052A[P]. 2015-10-28.

[13] 樊文乐，武文洁. 超临界萃取中夹带剂的概述[J]. 食品科技，2005（2）：39-42.

[14] 刘晓庚，陈梅梅，谢亚桐. 夹带剂及其对超临界CO2萃取效能的影响[J]. 食品科学，2004，25（11）：353-357.

[15] 赵丹，尹洁. 超临界流体萃取技术及其应用简介[J]. 安徽农业科学，2014（15）：4772-4780.

[16] 李倩，蒲彪. 超临界流体萃取技术在天然产物活性成分提取中的应用[J]. 食品与发酵科技，2011，47（3）：11-14.

[17] 陈岚. 超临界萃取技术及其应用研究[J]. 现代食品科技，2006，27（3）：65-68.

[18] 周也，田震，王丽雯. 超临界萃取技术研究现状与应用[J]. 山东化工，2012，41（5）：37-39.

[19] 何峰. 西柏三烯-4，6-二醇的分离纯化及热裂解和烟草中HPLC分析方法研究[D]. 郑州：郑州轻工业学院，2015.

Studying of Supercritical CO2Extraction of Cembratriene-diols from Tobacco Flowers

HE Kang1,2, ZHANG Huaibao1*, DU Yongmei1, LIU Xinmin1, KUAI Yan3, FU Qiujuan1

(1.Tobacco Research Institute of CAAS, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of CAAS, Beijing 100081, China; 3.Nanjian County Tobacco Company of Yunnan Province, Dali, Yunnan 671000, China)

The objective of this study was to extract cembratriene-diols in tobacco flowers environment-friendly and to establish the optimum process conditions of supercritical CO2extraction. The single factor test and response surface analysis were used to explore the influence of extraction time, extraction temperature, extraction pressure and the entrainer flow on the extraction amount of cembratriene-diols in tobacco flowers. The central composite design was carried on the basis of single factor experiment. The optimal extraction conditions were found to be extraction at 42 ℃ and 13.9 MPa for 120 min using ethanol as the entrainer at a flow velocity of 0.67 g/min. Under this condition, the predicted extraction amount of cembratriene-diols was 6.065 mg/g based on the response surface model. In this study, the actual extraction amount and extraction rate of cembratriene-diols were 5.978 mg/g and 97.1%, respectively. This suggested that efficient extraction of cembratriene-diols in tobacco can be achieved using the central composite design and response surface analysis.

tobacco;cembratriene-diols; supercritical CO2extraction; central composite design

TS41+1

1007-5119（2017）02-0081-07

10.13496/j.issn.1007-5119.2017.02.014

中国农业科学院科技创新工程（ASTIP-TRIC05）

何 康（1990-），男，在读硕士，研究方向为烟草化学。E-mail：13697667596@163.com。

，E-mail：huaibaozh@126.com

2016-12-06

2017-02-07