中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白和基质金属蛋白酶-9与肺腺癌预后的关系

张乃丹 袁成良 刘利洪 曾传蓉

(德阳市人民医院检验科，四川 德阳 618000)

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中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白和基质金属蛋白酶-9与肺腺癌预后的关系

张乃丹 袁成良 刘利洪 曾传蓉

(德阳市人民医院检验科，四川 德阳 618000)

目的 探讨中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)和基质金属蛋白酶(MMP)-9与肺腺癌患者预后的关系。方法 收治50例肺腺癌患者，免疫组化检测患者肿瘤组织中NGAL和MMP-9的表达，分析NGAL、MMP-9与临床预后的关系以及二者的相关性。结果 肺腺癌患者肿瘤组织中NGAL平均表达量为70%，MMP-9为30%。单因素分析显示NGAL水平、肿瘤分期均与患者总生存期(OS)相关。NGAL表达水平<70%的患者OS中位数是45.7个月(95%CI15.2～76.2个月)；NGAL表达水平≥70%的患者OS中位数是4.6个月(95%CI0.5～18.8个月；P<0.000 1)。Ⅲ期肿瘤患者 OS中位数是15.57个月(95%CI9.8～21.2)个月，Ⅳ期是9.6个月(95%CI0.8～18.4个月；P=0.002)。NGAL与MMP-9呈低度相关。MMP-9表达水平与OS差异无统计学意义(P>0.05)。结论 肿瘤组织中NGAL表达≥70%提示预后较差，MMP-9表达水平与预后无明显相关。

脂质运载蛋白；恶性腺癌；金属基质蛋白-9

中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)参与了细胞凋亡〔1，2〕、分化、验证免疫应答〔3〕、脂质代谢和肿瘤发生发展的多个过程〔4，5〕。基质金属蛋白酶(MMP)-9通过降解基底膜和细胞外机制参与了恶性肿瘤细胞的血管生成、侵袭和转移〔6〕。有研究显示〔7〕NGAL对MMP-9有正调控作用。有研究表明，在乳腺癌、食管癌、胃癌、胰腺癌和直肠癌组织中NGAL表达提示较差的预后，而在卵巢癌组织中NGAL表达提示较好的预后〔8，9〕。本研究旨在探讨NGAL与MMP-9在肺腺癌患者预后判断中的意义，分析NGAL和MMP-9在肺腺癌中的相关性。

1 材料与方法

1.1 一般资料 德阳市人民医院2012年1月至2016年1月收治的50例肺腺癌患者，排除组织病理为非腺癌的肺癌患者以及曾接受化疗和放疗者。其中男27例，女23例，年龄(61.4±7.1)岁，中位年龄61岁。38例有吸烟史。患者在诊断为肺腺癌时的肿瘤分期Ⅰ期9例，Ⅱ期7例，Ⅲ期11例，Ⅳ期23例。Ⅱ～Ⅳ期的患者均接受铂类细胞毒性化疗治疗(辅助或姑息)。患者随访(25.6±32.2)个月。所有患者肺癌组织经手术切除后立即置于液氮中保存备用，其余部分用10%多聚甲醛固定后送病理科做组织化学检测。治疗方案都遵循国际肺癌治疗原则〔3〕。

1.2 免疫组化检测 免疫组化采用标准的抗生素蛋白标记过氧化物酶法，样本组织先经石蜡包埋后切成4 μm厚切片，组织切片经脱蜡处理后置于3% H2O2内灭活内源性过氧化物酶，经柠檬酸抗原修复液修复后自然冷却，NGAL抗体按1∶100稀释(〔NGAL，GTX63306〕 Clone：EPR5084，品牌：GeneTex®)；MMP-9抗体按1∶200稀释〔MMP-9-GTX100458〕 Clone：NCl，品牌：GeneTex®Dilution 1∶200)，滴加一抗后4℃冰箱过夜；磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，3 min/次，后滴加聚合物辅助剂，室温孵育30 min后再用PBS冲洗3次，2 min/次；滴加辣根过氧化物酶标记的相应二抗，室温下孵育30 min；PBS冲洗3次，2 min/次，滴加DAB显色10～15 min，PBS冲洗干净终止反应。苏木精复染3 min，乙醇梯度脱水，放入透明二甲苯中10 s，中性树脂封片。

1.3 结果判定标准 所有切片均由本院1位经验丰富的病理科医生双盲观察。作为NGAL阳性参照的是子宫颈内膜腺细胞细胞质中强阳性染色片，作为MMP-9阳性参照的是肺泡巨噬细胞细胞质中强阳性染色片，阴性对照采用的一抗滴加PBS的切片。NGAL和MMP-9的表达以胞质中的棕黄色染色为阳性。根据棕黄色着色深浅以及阳性细胞数占肿瘤细胞总数的百分比计分，采用0～计分法(0，阴性；+弱阳性；强阳性)。

1.4 预后结果分析 无进展生存期(PFS)是指从随机化到病人出现肿瘤进展或死亡的时间，总生存期(OS)是指从随机化开始至因任何原因引起死亡的时间。NGAL、MMP-9表达与患者PFS关系的数据以表格形式列出；NGAL、MMP-9表达与OS关系以生存曲线形式表示。

1.5 统计学方法 应用SPSS19.0软件进行q检验、Dunettt-t检验和χ2检验。

2 结 果

2.1 NGAL和MMP-9蛋白表达 50例患者中，48例有NGAL蛋白表达，38例有MMP-9蛋白表达，见图1。NGAL表达阴性者组织中，MMP-9的表达也为阴性。大部分患者肿瘤组织中NGAL表达强度为(39例，78%)，MMP-9表达强度为(19例，38%)。患者肿瘤组织中平均NGAL和MMP-9表达百分比为70%和30%。NGAL表达<70%(n=11)患者，MMP-9表达的均值为(22.3±27)%；NGAL表达≥70 %(n=38)患者，MMP-9表达的均值为(52.1±39)%。相关分析结果显示，肺腺癌患者肿瘤组织中NGAL和MMP-9表达水平呈较弱相关性(P=0.007，r=0.48)，见图2。

图1 肺腺癌患者肿瘤组织NGAL、MMP-9蛋白表达(×400)

图2 肿瘤组织中NGAL与MMP-9蛋白相关性分析

2.2 NGAL、MMP-9表达与PFS 未得到Ⅰ～Ⅱ期肺癌患者PFS的相关数据。Ⅲ～Ⅳ期患者PFS中位数为10.8个月(95%CI5.9～15.7个月)。NGAL表达<70%提示具有较好PFS；NGAL表达≥70%提示PFS较差。MMP-9表达与PFS无明显相关，见表1。

2.3 NGAL、MMP-9表达与OS 50例肺腺癌患者OS中位数是17个月(95%CI：4.7～29.2个月)。单因素分析显示，患者肺癌确诊时的分期和NGAL表达水平是影响OS的直接因素。Ⅰ～Ⅱ期肺癌患者OS的相关数据未获得；Ⅲ期患者OS中位数15.57个月(95%CI：9.8～21.2个月)，Ⅳ期患者OS中位数9.6个月(95%CI：0.8～18.4个月，P=0.002)。NGAL表达<70%中位OS 45.7个月(95%CI：15.2～76.2个月)；NGAL表达≥70%中位OS 4.6个月(95%CI：0.5～18.8个月；P<0.000 1)。MMP-9表达<30%中位OS 36个月(95%CI：1.92～70.1个月)，MMP-9表达≥30%中位OS 15个月(95%CI：7.3～22.7个月)，两组差异无统计学意义(P=0.568)。见图3。

表1 肺腺癌患者PFS分析

图3 NGAL、MMP-9蛋白表达与OS分析

3 讨 论

目前国内外关于使用组织病理学指标判断肺癌患者临床预后的研究仍然存在诸多争论，且目前的研究并没有涉及肿瘤转移患者的预后判断〔10〕。本研究发现肺腺癌患者肿瘤组织中NGAL蛋白表达是肺腺癌独立危险因素，可能作为判断肺癌患者预后的新指标。

NGAL是载脂蛋白家族成员，该家族共有50多种成员，NGAL氨基酸序列和DNA内含子和外显子的排列与其他成员有着高度保守性，因此NGAL具有结合和转运疏水基团(如脂肪酸、前列腺素、花生四烯酸、类视黄醇类物质等)的功能，在免疫调节和维持细胞内环境稳态中具有重要意义〔5〕。NGAL通过将恶性肿瘤细胞外铁离子转运至胞质内，在肿瘤的增殖、分化和发展中具有促进作用〔11〕。有研究发现肝细胞生长因子、神经转换因子、PMA、视黄酸、糖皮质激素等促进肿瘤细胞增殖的因子均具有促进NGAL合成和释放的功能〔12〕。

NGAL是中性粒细胞来源的92 kD的MMP-9的共价键蛋白。通过形成NGAL/MMP-9二聚体，NGAL可以保护MMP-9不受蛋白酶的降解，从而MMP-9在细胞基质中表现出较强的明胶分解作用〔13〕。MMP-9的活性增强也是NGAL过表达时肿瘤侵袭和转移的原因之一〔7〕。NGAL/MMP-9复合物在肿瘤组织高表达多提示膀胱癌、脑瘤、乳腺癌、食管癌、胃癌和恶性血液癌预较差〔13〕。

本研究结果提示患者临床OS较差，且NGAL表达与预后的关系独立于肿瘤分期，而且提示NGAL对肺腺癌患者OS的影响是独立作用的并不依赖于MMP-9的交互作用。Zhang等〔14〕研究表明，在直肠癌中NGAL与MMP-9的表达提示直肠癌患者临床预后较好，而本研究结果显示NGAL表达提示肺腺癌患者临床预后较差，对此认为NGAL在肺腺癌组织的调控作用主要依赖于铁离子转运机制，降低细胞间E钙黏附素聚集，从而促进了新生癌细胞的侵袭与转移〔15〕，用铁离子螯合剂类药物阻断NGAL蛋白的表达可能成为治疗肺腺癌的潜在靶点。已有研究证明在动物模型上通过减少铁离子的储存和包括NGAL在内的铁离子运载体的表达，可以有效阻断肿瘤细胞增殖〔16〕。

本研究结果表明，肺腺癌患者肿瘤组织中NGAL蛋白表达是独立于肿瘤分期的，提示患者临床预后的新指标，肿瘤组织中NGAL蛋白表达≥70%多提示患者预后较差。肺腺癌患者肿瘤组织中MMP-9蛋白表达与患者临床预后以及与NGAL蛋白表达之间无明显相关，提示NGAL在肺腺癌患者肿瘤细胞的侵袭和转移过程中具有独立的分子机制。

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〔2016-12-19修回〕

(编辑 李相军)

张乃丹(1984-)，女，主管技师，主要从事临床免疫学诊断研究。

R730.261

A

1005-9202(2017)08-1935-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.049